Presentación PowerPoint. Módulo Biología Molecular y Citogenética del CFGS Laboratorio Clínico y Biomédico. Tema: Hibridación de los ácidos nucleicos.

1. B I O L O G Í A M O L E C U L A R Y C I T O G E N É T I C A
HIBRIDACIÓN DE
ÁCIDOS NUCLEICOS

2. CONCEPTOS GENERALES ÁCIDOS
NUCLEICOS
Para entender cómo funcionan las técnicas de hibridación, conviene
recordar las características físico-químicas de los ácidos nucleicos:
1. Compuestos por azúcar, bases nitrogenadas y ácidos fosfórico.
2. Complementariedad de bases: A=T; C≡G.
3. Regla de Chargaff: la proporción de A es igual a la T y la proporción de G es igual a la C.
A/T = 1; G/C =1.
4. Las dos hélices, por razones de complementariedad de las bases nitrogenadas, son
antiparalelas, teniendo secuencias de átomos inversas.
5. Puede desnaturalizarse perdiendo la estructura de doble hélice.

3. CONCEPTO DE HIBRIDACIÓN
La hibridación de ácidos nucleicos (ADN o ARN) consiste en la unión de dos moléculas
monocatenarias de ácidos nucleicos haciendo uso de la complementariedad de bases de su
secuencia. El resultado es una molécula híbrida bicatenaria.
Las técnicas de hibridación hacen uso de esta propiedad de los ácidos nucleicos para detectar
secuencias CONCRETAS de ácidos nucleicos (ADN o ARN) mediante el empleo de sondas marcadas
• Secuencia diana es la secuencia concreta de bases (cadena monocatenaria) que se quiere
detectar en la muestra del paciente. La que se quiere localizar en la muestra.
• Sonda cadena de nucleótidos cuya secuencia de bases es complementaria a la diana.
• Localizar genes específicos en la secuencia de ADN.
• Análisis de la expresión génica

4. BASES TEÓRICAS DE LAS TÉCNICAS DE
HIBRIDACIÓN
Cuando una molécula de ácido nucleico BICATERNARIO se somete a temperaturas elevadas (90ª-
100ºC), a condiciones de alcalinidad o a la acción de compuestos como urea, formamida o
formaldehído DESNATURALIZACIÓN los puentes de hidrógeno se rompen A.N monocatenario.
DESNATURALIZACIÓN
La desnaturalización, al igual que en proteínas, supone la pérdida de la conformación tridimensional de la
molécula. Puede ser REVERSIBLE BAJO CONDICIONES CONTROLADAS.
Por medio de las curvas de fusión podemos
representar el comportamiento del ADN
cuando lo sometemos a condiciones
desnaturalizantes

5. CURVA DE FUSIÓN
Las moléculas de ácidos nucleicos absorben luz a una longitud de onda de 260 nm. Si
monitorizamos la absorbancia a 260 nm de una solución que contiene ácido nucleico a medida que
aumentamos la temperatura obtendremos la curva de fusión
• Zona A: es un tramo recto que depende
exclusivamente de la concentración de ácido nucleico.
No se produce desnaturalización porque la Tª no es
suficiente para romper los enlaces de H. ADN
bicatenario.
• Zona B: se produce un aumento de la Abs a medida
que aumenta la Tª. Primero lentamente (cóncavo),
luego rápidamente (mucha pendiente). Finalmente
convexo. Se alcanza el valor de Abs máximo (100% de
desnaturalización).
• Zona C: es una recta de pendiente prácticamente nula.
No hay más desnaturalización porque ya ha llegado a
su máximo por más que aumente la temperatura.
La Abs aumenta con la Tª porque las moléculas
monocatenarias absorben más que las bicatenarias

6. PARÁMETROS DE LA CURVA DE FUSIÓN
Temperatura de fusión
Es la temperatura a la cual se produce la desnaturalización del 50% de la molécula. Se
abrevia como Tm (temperatura de melting)
En la temperatura de fusión tendrá mucha importancia el contenido de pares CG: a mayor
porcentaje de GC, mayor Tm.
¿Por qué? Los pares CG están unidos por 3 enlaces de hidrógeno. A mayor contenido de pares CG más
número de triples enlaces tendremos y, por tanto, mayor estabilidad tendrá la molécula de ADN. Por este
motivo necesitamos suministrar más temperatura para producir su desnaturalización.
Ejemplo

7. BASES TEÓRICAS DE LAS TÉCNICAS DE
HIBRIDACIÓN
RENATURALIZACIÓN
La desnaturalización se puede revertir bajo ciertas condiciones (bajada de temperatura)
renaturalización. Se recupera la forma inicial de la molécula de ácido nucleico. Sin
embargo, la renaturalización es un fenómeno de unión al azar y, por tanto, la molécula de
ADN renaturalizada no tiene por qué contener las hebras iguales.
A tener en cuenta:
• A mayor concentración de ácido nucleico, mayor será la velocidad de renaturalización.
• La renaturalización se producirá más fácilmente cuanto menos complejidad tenga el
ADN que se renaturaliza. La complejidad se relaciona con el número de secuencias
repetitivas que tenga.
• La renaturalización se produce por complementariedad de bases.
• Para que la renaturalización ocurra , la concentración de sales debe ser alta (elimina la
repulsión entre los grupos fosfato de las dos hebras).
• La Tª debe ser lo suficientemente baja. La óptima es de unos 20-25ºC debajo de la Tm

8. CINÉTICA DE LA RENATURALIZACIÓN
1. Fase de nucleación fase lenta en la que secuencias cortas de bases
complementarias se aparean por formación de puentes de H. La V de la
renaturalización se define con la siguiente fórmula:
2. Fase de “cierre en cremallera” fase rápida en la que se produce el cierre de
las secuencias vecinas originando la doble hélice.
La renaturalización es un proceso más complejo que sigue una cinética
distinta a la desnaturalización

9. CINÉTICA DE LA
RENATURALIZACIÓN
La velocidad de renaturalización del ADN de un organismo está relacionada con su
complejidad. La complejidad se define como la suma del número de nucleótidos que tiene
cada tipo de secuencia sin tener en cuenta el número de veces que está repetida.
El ADN de virus y bacterias es más sencillo porque tiene más secuencias únicas que
secuencias repetidas; el ADN de eucariotas es más complejo porque tiene secuencias únicas
y distintos tipos de secuencias repetidas.
Las curvas de renaturalización de virus y bacterias tienen forma
de S, tienen un solo punto de inflexión o punto medio de
reacción. Todas las secuencias son únicas y tienen la misma
probabilidad de encontrar a su complementaria para formar la
doble hélice
Este valor está directamente relacionado con la complejidad del ADN. A
mayor complejidad, mayor C0T1/2

10. CINÉTICA DE LA
RENATURALIZACIÓN
Las curvas de renaturalización de organismos eucariontes con diferentes tipos de
secuencias, poseen varios puntos de inflexión y son escalonadas. Cada uno de
estos puntos se corresponde con un tipo de secuencia: únicas, moderadamente
repetidas y altamente repetidas.
Para realizar las curvas de renaturalización de
grandes moléculas y genomas completos, el
ADN se fragmenta.

11. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA
HIBRIDACIÓN
Los factores que influyen en la hibridación son aquellos que pueden modificar la Tm de un
híbrido
1. Fuerza iónica de la solución: hace referencia a la cantidad de sales presentes en
la solución. Concretamente a cationes monovalentes (ej.: Na+). Estos iones son
capaces de neutralizar la carga negativa de la molécula de ácido nucleico (dada por
los fosfatos) y consigue darle ESTABILIDAD. Por tanto, a mayor fuerza iónica, mayor
cantidad de calor hay que suministrar a la molécula para desnaturalizarla. La curva
de fusión se desplaza hacia la derecha (más Tª) cuando aumenta la concentración de
sales. Aumenta la Tm.
2. Agentes desnaturalizantes: formamida, dimetilsulfóxido entre otros. Desestabilizan
los puentes de H, facilitando su ruptura. Si se añaden al híbrido, baja su Tm y la
curva se desplaza a la izquierda. Hace falta menos energía para desnaturalizar la
molécula.
3. Mismatch o % de bases no complementarias: a mayor mismatch, menor Tm. Para
sondas de gran tamaño la Tm del híbrido disminuye por cada 1% de mismatch. Para
sondas pequeñas, una única base pueden disminuir varios grados la Tm del híbrido.

12. LAS SONDAS
Características generales
• Bicatenarias o monocatenarias.
• Tamaño variable (de pequeños oligonucleótidos) a grandes moléculas.
• Específicas hace referencia a la capacidad de la sonda de identificar a la
secuencia con la que tiene que hibridar. El tamaño mínimo para que sea
específica son 16 bases.
• Sensibles hace referencia a la probabilidad de detectar cantidades
mínimas del híbrido-diana. Relacionado con el número de moléculas
marcadoras que admite la sonda.
• Pueden ser de distintos tipos según su naturaleza: sondas de ADN, sondas
de ARN y sondas químicas sintéticas de ácidos nucleicos.

13. MARCAJE DE LAS SONDAS
El marcaje de las sondas nos permite su detección. Se trata del procedimiento de
marcar la sonda con la finalidad de poder visualizar los resultados
TIPOS DE
MARCADORES
1. Isótopos radiactivos consiste en utilizar una soda unida a un compuesto
que emita radiactividad. Las sondas así marcadas se detectan
cuantitativamente por contaje en un contador de cetelleo y cualitativamente por
autorradiografía. Este tipo de marcaje permite detectar entre 0,2 y 1 pg de ADN.
Se utilizan sobre todo para Northern Blot, Southern Blot o Dot Blot.
2. Fluorocromos son compuestos químicos que emiten luz al ser excitados por
la luz UV. Se utilizan sobre todo en FISH. Para su detección se requiere de un
microscopio de fluorescencia. Permiten obtener los resultados en tiempos más
cortos que los métodos radiactivos. El uso combinado de diferentes
fluorocromos permite la detección simultánea de diferentes secuencia diana.

14. MARCAJE DE LAS SONDAS
TIPOS DE
MARCADORES
3. Haptenos son moléculas de pequeño tamaño que, al igual que los
fluorocromos, se pueden acoplar a los nucleótidos y no alteran la especificidad de
la sonda, aunque no pueden ser detectados directamente. Se pueden usar en
prácticamente todas las técnicas de hibridación. Los más utilizados son la
digoxigenina y la biotina.
Ejemplo de FISH
Ejemplo de marcaje con
biotina

15. MÉTODOS DE MARCAJE
Nick translation (desplazamiento de mella)
Este método de marcaje utiliza sondas de ADN bicatenario obtenido habitualmente mediante
tecnología de ADN recombinante.
Necesitamos una mezcla de los 4 desoxirribonucleótidos, uno de ellos marcado, normalmente
con isótopos radiactivos, y la participación de las enzimas: ADNasa I, ADN polimerasa I.
La ADN polimerasa I
desplaza la mella a lo largo
de la cadena de ADN,
sustituyendo ADN sin marcar
por ADN marcado

16. MÉTODOS DE MARCAJE
Cebado al azar (random priming)
Método alternativo al anterior, también utilizado para sondas bicatenarias de gran tamaño. En
este caso solo se requiere la actuación de una enzima (fragmento de Klenow) que mantiene
actividad polimerasa, pero no exonucleasa. Necesitamos también una mezcla de todos los
oligonucleótidos posibles de 6 bases (hexámeros) y desoxirribo marcados.

17. MÉTODOS DE MARCAJE
Marcaje terminal
• Se utiliza para marcar sondas de ADN bi o monocatenario de pequeño y
mediano tamaño.
• Se pueden utilizar isótopos radiactivos, fluorocromos o haptenos.
• Interviene la enzima TdT polimerasa capaz de incorporar
desoxirribonucleótidos al extremo 3’ OH libre de una molécula de ADN sin
necesidad de cadena molde.
• La TdT incorpora todo tipo de nucleótidos marcados.
• Dos posibles tipos de marcaje:
• Marcaje único en el extremo 3’ se incorpora un único nucleótido
marcado en el extremo 3’ de la sonda. Este nucleótido detiene la síntesis
porque no tiene OH libre en el carbono 3’.
• Incorporación de cola de nucleótidos marcados se añade cola
marcada de longitud variable.

18. TIPOS DE SONDAS
Las sondas utilizadas en las técnicas de hibridación puede ser de: ADN, ARN o
síntesis química.
Dentro de éstas hay, a su vez, otros tipos:
1. SONDAS DE ADN son las más utilizadas por ser fáciles de obtener en
grandes cantidades . Versatilidad en tamaño y métodos de marcaje. Sus
cinéticas de desnaturalización y renaturalización son las más comprendidas.
Hay varios tipos:
(1)De síntesis química: obtenidas por condensación química secuencial
de los desoxirribonucleótidos específicos que interesan incorporar para obtener una
secuencia determinada. Son sondas monocatenarias y de tamaño reducido. Son de
baja sensibilidad y tienen facilidad para hibridar inespecíficamente con secuencias
parecidas a la diana.

19. TIPOS DE SONDAS
(2) ADN recombinante: se obtienen por un proceso de clonación y amplificación
por cultivo. Son sondas bicatenarias (precisa desnaturalización); de gran tamaño
(aumenta su sensibilidad); no suelen hibridar inespecíficamente (más
especificidad).

20. TIPOS DE SONDAS
(3) De PCR consiste en amplificar el fragmento que nos interesa como sonda
mediante la reacción en cadena de la polimerasa. Este método implica conocer
las secuencias que flanquean el fragmento que queremos amplificar. Se
caracterizan por ser bicatenarias y de tener un tamaño intermedio (cientos de
bases).

21. TIPOS DE SONDAS
SONDAS DE ARN ribosondas. Menos utilizadas que las sondas de ADN. Son
siempre monocatenarias (el ARN es monocatenario) por lo que no precisan
desnaturalización.
Los híbridos ADN/ARN son ligeramente más estables que los híbridos ADN/ADN.
Son muy sensibles a cualquier contaminación (se degradan por las ARNasas).
Tipos de sondas de ARN:
(1) De síntesis química: obtenidas por condensación química secuencial
de los ribonucleótidos concretos que interesa para obtener una secuencia
determinada.
(2) Transcripción: consiste en transcribir un vector que contiene el
fragmento de interés o un ADNc mediante una ARN polimerasa. Son de tamaño
intermedio.

22. TIPOS DE SONDAS
SONDAS QUÍMICAS SINTÉTICAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS: Dos tipos:
(1) Sondas de ácidos nucleicos peptídicos: también llamados PNA. El
esqueleto típico de los ácidos nucleicos (azúcar-fosfato) se sustituye por un
esqueleto de poli-aminoetil-glicina.
A cada residuo de aminoetil-glicina se le acopla una base nitrogenada acetilada y
la unión tiene lugar a través del grupo carbonilo del radical etilo.
Estas sondas hibridan
con cadenas de ADN y
ARN de secuencia
complementaria
mediante puentes de H
entre bases
complementarias.

23. TIPOS DE SONDAS
(2) Sondas de ácidos nucleicos bloqueados: Los ácidos nucleicos
bloqueados o LNA (locked nucleic acid) son oligómeros sintéticos de
ribonucleótidos, en los que se modifican químicamente algunas de las
ribosas del esqueleto azúcar-fosfato mediante la formación de un puente de
oxígeno entre el carbono 2' y el
carbono 4’.
Las sondas LNA presentan mayor sensibilidad y especificidad que las de
ARN sin modificar.
Al igual que las sondas PNA, se obtienen solo por síntesis química, son de
pequeño tamaño y se usan principalmente en técnicas de hibridación in situ.

24. FASES DE LA HIBRIDACIÓN
Normalmente se siguen 4 fases genéricas:
• Preparación de la muestra y soporte (prehibridación) según la
técnica se pueden desarrollar múltiples pasos (digestiones enzimáticas,
transferencias, electroforesis, etc.).
• Hibridación es la fase en la que se produce la unión de la sonda con la
secuencia diana de la muestra del paciente.
• Lavado de poshibridación fase crítica del proceso de hibridación. El
objetivo es eliminar los híbridos imperfectos sin eliminar los híbridos que
nos interesan. Depende de la especificidad de la técnica.
• Detección del híbrido la detección se realiza gracias al marcaje de la
sonda y en función del marcador utilizado (radiactivo, fluorocromos,
haptenos).

25. FASES DE HIBRIDACIÓN
Fase de hibridación:
• Tm del híbrido la mayor eficiencia en la hibridación se consigue con temperaturas
de Tm-32 y Tm-16ºC, siendo máxima a Tm-25ºC.
• La hibridación se suele realizar a temperaturas prefijadas estándar.
• Debe realizarse en condiciones relajadas la idea es conseguir la estabilidad del
híbrido. Para ello se utilizan bajas concentraciones de formamida (es un agente
desnaturalizante) y altas concentraciones de cationes monovalentes (neutralizan la
carga negativa del ácido nucleico y lo estabilizan). Para fijar la concentración de
cationes se utiliza el tampón SSC 20x).
• El tiempo de hibridación varía según la técnica pero oscila entre 30 minutos y 24
horas.

26. FASES DE LA HIBRIDACIÓN
Lavado poshibridación:
• El lavado se realiza con un tampón en el que se fija las condiciones de
RIGUROSIDAD, combinando temperatura de lavado, fuerza iónica y concentración
de formamida.
Cuanto menor sea X, mayor será la rigurosidad del lavado y, por lo tanto, se conseguirá
mayor especificidad. Como inconveniente, para valores de X inferiores a 15 empieza a
disminuir la sensibilidad, puesto que se trabaja en zonas de la curva de eficiencia de
hibridación fuera de la zona de máximos.
El lavado normalmente se realiza en condiciones de rigurosidad elevada, permitiendo
que se mantengan estables solo los híbridos con bajo o ningún porcentaje de mismatch.
A veces interesa mantener cierto grado de mismatch condiciones de rigurosidad
relajadas.

27. A TENER EN CUENTA
Cuando hablamos de condiciones de elevada rigurosidad nos referimos a:
• Temperatura de lavado elevada.
• Tampón con baja concentraciones de sales (de cationes monovalentes).
• Tampón con alta concentración de formamida (hasta un 50%).
Cuando hablamos de condiciones de rigurosidad relajadas nos referimos a:
• Tampón con alta concentración salina (cationes monovalentes).
• Tampón con baja concentración de formamida (menor de 10%).