Chromatography - principle, types and uses Thin layer chromatography Paper chromatography Column chromatography Ion exchange chromatography Gel permeation chromatography Affinity chromatography Gas chromatography Liquid chromatography (HPLC, FPLC, Liquid chromatography–mass spectrometry (LC–MS)

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6.SOME BASIC CONCEPTS OF BIOCHEMISTRY FOR DMLT SECOND YEAR STUDENTS
(U. P. State Medical Faculty syllabus) in Hinglish
Lesson 6
[Chromatography]
CHROMATOGRAPHY
Chromatography एक तकनीक है जिसका इस्तेमाल laboratory में किसी मिश्रण क
े अवयवों क
े पृथक्करण
(separation), identification और purification क
े लिए किया जाता है ताकि उन अवयवों का गुणात्मक
(qualitative) और मात्रात्मक (quantitative) विश्लेषण (analysis) किया जा सक
े I
Principle -
इस तकनीक में जब किसी मिश्रण को किसी स्थिर (stationary) phase पर apply करते हैं और फिर इसे किसी
liquid क
े प्रवाह (mobile phase) क
े अधीन करते हैं तो उस मिश्रण क
े अवयवों का पृथक्करण उन अवयवों क
े
stationary और mobile phase क
े प्रति सापेक्ष लगाव (relative affinity) पर आधारित होता है I मिश्रण क
े
molecules का separation उन molecules की adsorption (liquid-solid), partition (liquid-solid), और
affinity या उनक
े molecular weights में विभिन्नता जैसी molecular characteristics पर निर्भर करता है I
इन विभिन्नताओं क
े कारण मिश्रण क
े क
ु छ अवयव stationary phase में अधिक देर तक रहते हैं और
chromatography system में धीरे move करते हैं, जबकि दूसरे अवयव अधिक तेजी से move करते हुए
system को जल्दी छोड़ देते हैं I इस प्रकार अवयवों का पृथक्करण हो जाता है I
Chromatography विभिन्न प्रकार की होती हैं किन्तु इनमें से महत्वपूर्ण प्रकार हैं :
● Thin layer chromatography
● Paper chromatography
● Column chromatography
● Ion exchange chromatography
● Gel permeation chromatography
● Affinity chromatography
● Gas chromatography
● Liquid chromatography [High-pressure (or high performance) liquid chromatography,
HPLC and fast protein liquid chromatography, FPLC]
Thin layer chromatography -
Thin-layer chromatography एक प्रकार की “solid-liquid adsorption” chromatography है I इस method
में stationary phase एक solid adsorbent substance (such as alumina, silica gel, cellulose) की होती
है जिसे glass plates पर coat करा जाता है और mobile phase एक solvent होता है I जिस मिश्रण का
separation करना होता है उसक
े solution को एक छोटे spot क
े रूप में plate क
े एक सिरे से 2 cm ऊपर apply
किया जाता है I इस plate को थोड़े solvent से भरे एक closed jar में रखते हैं (जैसा नीचे चित्र में दिखाया गया है)
I यह solvent capillary action द्वारा plate की stationary layer पर धीरे - धीरे ऊपर चढ़ता है और अपने साथ
मिश्रण क
े components को different flow rates से carry करता है I इस तरह analytes का separation होता
है और इनकी upward travelling rate material, solid phase और solvent की polarity पर निर्भर करती है I
मिश्रण क
े polar components silica (stationary phase) से मजबूती से चिपकते हैं और इसलिए धीमे आगे
बढ़ते हैं, जबकि कम polar या nonpolar components कम चिपकने क
े कारण अपेक्षाकृ त तेजी से solvent
(mobile phase) क
े साथ ऊपर चढ़ते हैं I Colorless molecules क
े separation में fluorescence,
radioactivity या कोई specific chemical substance का इस्तेमाल करते हैं ताकि इनसे बनने वाले coloured

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reactive products को room light या UV light में देखकर separated molecules क
े chromatogram में
पहचान की जा सक
े I मिश्रण क
े प्रत्येक molecule की position को molecule और solvent द्वारा चली
distance क
े ratio द्वारा मापा जाता है I इस मापी गई value को relative mobility कहते हैं और इसे symbol
Rf (retention factor) द्वारा दर्शाते हैं I
​
Paper chromatography -
Paper chromatography में एक thick filter paper support material की तरह काम करता है और इसक
े
pores में बसे (settled) water drops stationary “liquid phase" बनाते हैं I एक developing tank में एक
appropriate fluid mobile phase का काम करता है I इस प्रकार stationary liquid phase filter paper क
े
pores में बसा water और mobile phase का fluid paper क
े through pass होता है I जब mobile phase
move करती है तो mixture में present compounds stationary और mobile phase क
े प्रति अपनी affinity
में अंतर क
े आधार पर separate होते हैं और यह paper क
े pores क
े capillary action क
े अंतर्गत होता है I
हालांकि, अधिकतर paper chromatography partition chromatography क
े सिद्धांत पर आधारित होती है
किन्तु कभी - कभी but यह adsorption क
े सिद्धांत पर भी काम करती है जिसमें stationary phase silica या
alumina से संसेचित (impregnated) paper adsorbent का काम करता है और solvent mobile phase की
तरह I
Types of Paper Chromatography
1.Ascending Paper Chromatography -
जैसा कि नाम से विदित होता है, इसमें developing solvent नीचे से ऊपर की ओर move करता है I इस प्रक्रिया
में mobile phase की पर्याप्त मात्रा development chamber में डालते हैं I Sample और reference (sample
क
े पृथक हुए components को पहचानने क
े लिए) को, एक hook या clip से chamber में लटक
े paper क
े निचले
सिरे से क
ु छ सेंटीमीटर ऊपर, एक spot क
े रूप में अलग - अलग apply करते हैं I
2.Descending Paper Chromatography -
इसमें mobile phase को developing chamber में ऊपर बने एक trough (परनाली) में रखते हैं जिससे solvent
लटक
े हुए paper पर ऊपर से नीचे की ओर move करता है I Sample और reference क
े spot को paper क
े
ऊपरी सिरे से क
ु छ सेंटीमीटर नीचे लगाते हैं I प्रक्रिया शुरू करने से पहले chamber को cover कर देते हैं ताकि
mobile phase की vapour chamber में भर जाए I
3.Ascending – Descending Chromatography -
इसमें solvent एक rod पर folded paper पर पहले नीचे से ऊपर move करता है और फिर rod को cross करने
क
े बाद नीचे को move करता है I

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4.Horizontal or Circular Paper Chromatography -
इस प्रक्रिया में liquid phase का movement radial (अर्धव्यास) होता है जिससे sample क
े components का
separation संक
ें द्रित वृत्ताकार क्षेत्र (concentric circular zones) क
े रूप में होता है
5.Two-Dimensional Chromatography - यह विधि उन complex mixtures क
े separation क
े लिए
इस्तेमाल होती है जिनक
े components की polarity समान होती है, जैसे - अमीनो एसिड्स I इसमें square या
rectangular paper इस्तेमाल करते हैं और sample spot को paper क
े एक कोने पर apply करते हैं तथा पहले
solvent नीचे से ऊपर move करता है, फिर paper को clockwise 90° घुमाकर दूसरे solvent क
े साथ run करते
हैं I इससे components का separation अच्छा होता है I
Column chromatography
Column chromatography solids और liquids क
े separation और purification का एक महत्वपूर्ण method
है I इसमें mixture क
े components का separation उनकी polarity या hydrophobicity तथा mobile phase
और stationary phase क
े बीच उनकी partitioning में अंतर क
े आधार पर होता है I इसक
े लिए विभिन्न size क
े
columns इस्तेमाल कर सकते हैं जिनको किसी adsorbent (a substance to which molecules can adhere
without making any chemical bond) से भर कर stationary phase बनाते हैं I आमतौर पर alumina
(Al2O3) और silica gel (SiO2) को adsorbent की तरह इस्तेमाल करते हैं और ये दोनों ही polar प्रकृ ति क
े होते
हैं I Polar और nonpolar component वाले sample mixture को इस column क
े ऊपर load कर देते हैं I जब
एक nonpolar solvent (eluent) को mobile phase क
े तौर पर इस adsorbent column से pass करते हैं तो
mixture क
े nonpolar molecules इस nonpolar eluent में घुल जाते हैं और column से pass होकर बाहर
निकलते हैं I इस तरह collected eluent (called 'eluate') में nonpolar sample molecules होंगे जबकि
polar sample molecules column क
े adsorbent में adsorbed रह जाएंगे I अब अगर इस column से एक
polar solvent (eluent) को pass करेंगे तो column में adsorbed polar molecules अपनी polarity क
े
आधार पर polar solvent में घुल जायेंगे I इस eluate को अलग - अलग flask में एकत्र करक
े हम विभिन्न
compounds का separation कर सकते हैं I

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Ion exchange chromatography
Ion exchange chromatography या ion chromatography वो प्रक्रिया है जिसमें ions और polar
molecules का separation उनकी ion exchanger क
े प्रति आकर्षण (affinity) क
े आधार पर होता है I इसका
इस्तेमाल आमतौर पर charged biological molecules,जैसे - proteins, peptides, amino acids, या
nucleotides क
े separation क
े लिए होता है I
Ion- exchange chromatography charged protein groups और solid support material (matrix) क
े बीच
electrostatic interactions पर आधारित है I Matrix का ion load separate की जाने वाली protein क
े विपरीत
होता है I दो प्रकार क
े ion exchangers का matrix क
े रूप में इस्तेमाल होता है - (i) cation exchangers जैसे -
carboxymethylcellulose (CM- cellulose), जिनमें negatively charged groups होते हैं और ये positively
charged cations को आकर्षित करते हैं ; (ii) anionic exchangers जैसे - diethylaminoethyl cellulose
(DEAE- cellulose), जिनमें positively charged groups होते हैं और जो negatively charged anions को
attract करते हैं I Proteins को column से separate करने हेतु buffer का pH, ion salts का concentration
या ionic strength बदलते हैं I
Gel permeation (gel filtration/molecular sieve) chromatography
यह chromatography partition chromatography का ही एक रूप है जिसमें macromolecules (जैसे -
proteins) का separation उनक
े molecular size में अंतर क
े आधार पर किया जाता है I एक gel- permeation
column में stationary phase small pores वाले inert molecules का बना होता है I विभिन्न प्रकार क
े
materials जैसे - dextrans (Sephadex™ series), agarose (Sepharose™ series), polyacrylamide
(bio-Gel series), polyvinyl ethyl carbitol, polyvinylpyrrolidone, cellulose, silica-based materials, या
mixtures जैसे - dextran-polyacrylamide (Sephacryl™ series) या dextran–agarose (Superdex™
series) का इस्तेमाल column तैयार करने में किया जाता है I विभिन्न size क
े molecules से बना solution इस
column से continuously और एक constant flow rate क
े साथ pass किया जाता है I gel क
े pores से बड़े
size क
े molecules इन pores में नहीं घुस सकते, इसलिए gel particles क
े बीच एक restricted area में रुक
जाते हैं I इस तरह बड़े molecules porous gel particles क
े बीच क
े space से pass हो जाते हैं और column से

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जल्दी pass हो जाते हैं किन्तु pores से छोटे molecules gel particles क
े pores में घुस जाते हैं और column
से अधिक समय में pass होते हैं I
Affinity chromatography
Affinity chromatography भी एक separation method है जो एक immobilized ligand और इसक
े binding
partner क
े बीच एक specific binding interaction पर आधारित है (जैसे - antibody/antigen,
enzyme/substrate, और enzyme/inhibitor interactions) I Affinity chromatography में stationary
phase बना होता है एक support medium (e.g. cellulose beads) से, जिसपर substrate (ligand) क
ु छ इस
तरह covalently bound होता है कि target molecules से binding क
े लिए आवश्यक reactive groups
exposed रहते हैं I जब substances का एक मिश्रण इस column से pass किया जाता है तो वो substances,
जिनमें immobilized substrate क
े लिए binding sites होती हैं, stationary phase से bind कर जाते हैं, जबकि
वो बाकी अन्य substances column क
े void volume में elute हो जाते हैं (Void volume refers specifically
to the volume of the liquid phase contained inside a column) I एक बार जब दूसरे substances elute
हो जाते हैं, तब bound target molecules को methods, जैसे - mobile phase में कोई competing ligand
को शामिल करक
े या eluting buffer क
े pH, ionic strength या polarity conditions को बदल कर, द्वारा elute
किया जा सकता है I
Gas chromatography
यह एक “gas-liquid” chromatography है, जिसमें column में एक liquid stationary phase होती है जो एक
inert solid की सतह पर adsorb होती है I इसमें mobile phase एक inert gas (helium, argon) या एक
unreactive gas (nitrogen, hydrogen) होती है जिसे column से high pressure में pass किया जाता है I
जिस sample को analyze करना होता है उसे पहले vaporize करते हैं और तब यह gaseous mobile phase
में enter करता है I Sample क
े components mobile phase और stationary phase क
े बीच disperse हो
जाते हैं I Gas chromatography बहुत छोटे molecules और कम amount क
े sample में separation क
े लिए
एक simple, highly sensitive, और rapid तकनीक है I Gas chromatography (GC) द्वारा clinical

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samples, जैसे - body fluids और tissue homogenates, को infection क
े markers क
े detection हेतु
analyze कर सकते हैं I Gas chromatography (GC) द्वारा microorganisms को chemically
characterize भी कर सकते हैं I
Liquid chromatography :
High-pressure or high performance liquid chromatography (HPLC)
यह technique amino acids, carbohydrates, lipids, nucleic acids, proteins, steroids, और दूसरे
biologically active molecules क
े separation और identification क
े लिए उत्तम है I HPLC में mobile
phase एक columns से 10–400 atmospheric pressure पर और high flow rate से pass की जाती है I इस
technique में small particles क
े इस्तेमाल और solvent क
े flow rate पर high pressure क
े प्रयोग क
े कारण
separation power बढ़ जाती है और बहुत कम समय में analysis पूरी हो जाती है I इसी कारण HPLC,
traditional liquid chromatography की अपेक्षा कम समय में बेहतर separation करने में सक्षम होती है I
HPLC device क
े आवश्यक components हैं - solvent depot, high- pressure pump, commercially
prepared column, detector और recorder l Separation का duration एक computerized system द्वारा
control किया जाता है I
HPLC विभिन्न प्रकार क
े clinical अनुप्रयोगों (applications) क
े लिए उपयुक्त है, जिनमें शामिल हैं
pharmaceutical development, legal application जैसे - urine और blood में अवैध (illicit) drugs क
े
detection आदि I HPLC को अक्सर hemoglobinopathies, thalassemias की accurate diagnosis और
glycosylated hemoglobin (HbA1c) क
े estimation में इस्तेमाल किया जाता है I हालांकि, यह एक महंगी
तकनीक है किन्तु इसकी accuracy लगभग अद्वितीय हैं I
Fast protein liquid chromatography (FPLC)
FPLC भी liquid chromatography का एक प्रकार है जिसका उपयोग large biomolecules जैसे - proteins,
nucleotides, और peptides क
े separation और purification में होता है I FPLC में mobile phase एक
buffer होता है और stationary phase beads से बना एक resin होता है जो आमतौर पर cross-linked
agarose होता है जिसे एक cylindrical glass या plastic column में pack किया जाता है I Sample

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components का separation इन components क
े moving fluid (mobile phase) और porous solid
material (stationary phase) क
े प्रति affinity पर आधारित होता है I
FPLC एक fast और reliable technique है जिसका इस्तेमाल body fluids जैसे - plasma, urine और
cerebrospinal fluids में markers की study क
े लिए होता है I Lipoprotein profile भी FPLC द्वारा प्राप्त कर
सकते हैं I इसी तरह, इस technique का उपयोग polynucleotides क
े detection द्वारा RNA और plasmid
DNA क
े rapid purification में भी किया जा सकता है I
Difference Between HPLC and FPLC -
HPLC liquid chromatography का ही एक प्रकार है जिसका उपयोग अधिकतर small molecular weight
compounds क
े separation और identification में होता है, जबकि FPLC भी liquid chromatography का
एक प्रकार है किन्तु इसका उपयोग large biomolecules जैसे - proteins, nucleotides, और peptides क
े
separation और purification क
े होता है I
Liquid chromatography–mass spectrometry (LC–MS) - एक अनुबद्ध (tandem) technique है जो एक
mixture क
े components क
े separation (liquid chromatography द्वारा) और प्रत्येक component क
े
identification (mass spectrometry द्वारा) का combination है I LC-MS, biological tissue (e.g., blood
plasma, serum, urine) की metabolite profiling में इस्तेमाल होने वाली techniques में से एक सबसे अधिक
इस्तेमाल होने वाली technique है I Drug development में अक्सर इसका उपयोग होता है I
Mass spectrometry द्वारा किसी chemical sample में present molecules क
े mass-to-charge ratio क
े
आधार पर उनकी qualitative and quantitative analysis करते हैं I ऐसा करने क
े लिए molecules को
electrons क
े एक shower द्वारा ionize करते हैं, फिर इन ionized particles को एक magnetic field से pass
करते हैं जिससे वे विक्षेपण (deflection) की different stages में separate हो जाएं I जब particles separate
हो जाते हैं तब उन्हें एक electron multiplier द्वारा measure करते हैं और प्रत्येक ion क
े mass क
े आधार पर
उस sample की बनावट की पहचान कर सकते हैं I Mass spectrometry में इस्तेमाल होने वाले instrument को
mass spectrometer कहते हैं I यह molecular spectrometry क
े लिए एक ultrahigh sensitive, specific
और low turnaround time वाली technique है I
Mass spectrometer principle

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Some practice questions
Fill in the blanks -
(i) Chromatography द्वारा हम laboratory में किसी मिश्रण क
े अवयवों का _______, identification और
purification कर सकते हैं I
(ii) Chromatography में मिश्रण क
े molecules का separation उन molecules की ______, partition,
affinity या उनक
े _____ weights में विभिन्नता जैसी molecular characteristics पर निर्भर करता है I
(iii) Thin layer Chromatography में stationary phase एक solid _______ substance की होती है जिसे
glass plates पर coat करा जाता है और mobile phase एक ______ होता है I
(iv) Column Chromatography में mixture क
े components का separation उनकी polarity या
hydrophobicity तथा mobile phase और stationary phase क
े बीच उनकी ________ में अंतर क
े आधार पर
होता है I
(v) CM- cellulose एक _______ exchanger है और DEAE- cellulose एक _______ exchanger है I
(vi) Gas chromatography में mobile phase एक _______ gas या _______ gas होती है I
(vii) HPLC का full form है _____________
(viii) HPLC में solvent क
े flow rate पर high _______ क
े प्रयोग क
े कारण separation power बढ़ जाती है
और बहुत कम समय में analysis पूरी हो जाती है I
(ix) FPLC का full form है ____________
(x) HbA1C का estimation आजकल सबसे अधिक _________ method द्वारा किया जाता है I
(xi) LC-MS का full form है ________ chromatography-mass _________.
(xii) Gas chromatography में इस्तेमाल होने वाली helium/ argon _______ gas हैं और nitrogen
/hydrogen _______ gas हैं I
Ans. (i) पृथक्करण, (ii) adsorption, molecular, (iii) adsorbent, solvent, (iv) partitioning, (v) cation,
anion, (vi) inert, unreactive, (vii) high pressure or high performance liquid chromatography, (viii)
pressure, (ix) Fast protein liquid chromatography, (x) HPLC, (xi) Liquid, spectrometry (xii) inert,
unreactive
REFERENCES
1. Coskun O. Separation techniques: Chromatography, North Clin Istanb. 3(2): 156–160,
2016.
Disclaimer : The pictures given in the text have been downloaded from Google images and I
am thankful to the persons who have uploaded these pictures.
Dr. P. K. Nigam
Ph. D.
Retired Biochemist