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Cuantificación novel de fármacos biotecnológicos
oncológicos mediante la aplicación de técnicas
instrumentales de última generación
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> Introducción a los fármacos biotecnológicos
• Los fármacos biotecnológicos son producidos a partir de técnicas
de biotecnología y son de naturaleza proteica (proteínas
recombinantes, anticuerpos monoclonales, péptidos, etc.).
• Fármacos con estructura grande (Kdaltons), compleja, inestable y
susceptible a múltiples modificaciones.
• Su caracterización es compleja debido a la mezcla de moléculas
relacionadas presentes en la matriz biológica.
• Existe relación entre la exposición y la respuesta (terapéutica o
tóxica) (ej, cetuximab).
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> Introducción a los fármacos biotecnológicos monoclonales – trastuzumab
• Trastuzumab (Herceptin®) anticuerpo monoclonal humanizado
indicado para el cáncer de mama HER2+.
• Fórmula C6470H10012N1726O2013S42
• Peso mol. 145531.5 g/mol
• Secuencia de AA y una estructura conocida.
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> Se carece de métodos de análisis aplicables …
• Las casas comerciales que distribuye los fármacos no facilitan
métodos cuantitativo para el análisis específico de sus fármacos en
plasma.
• Se carece en el mercado de kits inmunoquímicos (ELISA) para tal
uso.
• En el ámbito científico hay grupos de investigación que han
desarrollado métodos “inhouse” basados en anticuerpos
policlonales.
• Al ser fármacos proteicos no pueden ser analizados mediante
técnicas instrumentales clásicas.
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> ¿ Por que es de interés controlar los niveles de los fármacos ?
• Permite ajustar los tratamientos (frecuencias y/o dosis) de
manera personalizada.
• Esta demostrada la variabilidad interpaciente en los procesos de
absorción, distribución y eliminación lo cual condiciona los niveles
séricos y que su respuesta sea tóxica o terapéutica.
• Ajustar las dosis permite obtener en todo momento la cantidad
terapéutica óptima.
• Minimiza posibles efectos segundarios no deseados.
• Con lo que se optimiza los tratamientos y los recursos.
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> Objetivo del proyecto
• Desarrollar una metodología instrumental para cuantificar
anticuerpos terapéuticos monoclonales basada en sistemas
avanzados de cromatografía líquida de alta resolución acoplada a
espectrómetros de masas de última generación.
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> Estructura de las IgG
• 1. Región Fab
•2. Región Fc
•3. Cadena pesada con un dominio
variable seguido por un dominio
constante una región bisagra, y dos
más constantes, los dominios.
•4. Cadena ligera con un dominio
variable y uno constante
•5. Lugar de unión al antígeno
(paratopo)
•6. Regiones bisagra
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> Digestión enzimática y posterior identificación de los péptidos resultantes
Anticuerpo
Monoclonal
Terapéutico
péptidos
Caracterización
Instrumental
LC-Ms
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Fármaco monoclonal
(analito)
Plasma humano
(matriz)
Digestión enzimática
Caracterización peptídica
LC-Ms (TOF)
¿Péptidos
específicos?
Método cuantitativo
LC-Ms (QqQ)
Validación
Aplicación a estudios
farmacocinéticos
SINO
> Esquema de la estrategia del plan de trabajo
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> Digestión enzimática y posterior identificación de los péptidos resultantes
Cromatograma Trastuzumab digerido :
Péptido específico 1
Péptido específico 2
Total ion current
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> Resultados del proyecto:
• Se encontraron 2 péptidos específicos de la zona variable del
trastuzumab, de los cuales se seleccionó el de mayor sensibilidad y
selectividad para desarrollar el método cuantitativo
• Se desarrolló un método cuantitativo con un LOQ de 10 mg/L que incluye
• Pretratamiento del plasma,
• Purificación de las IgGs,
• Digestión enzimática
• Cuantificación del péptido específico mediante LC-Ms/Ms (modo MRM).
• El método se validó en el rango 10–200 mg/L y cumplió los requisitos
establecidos (FDA).
• Linealidad: El 92.6% de los patrones tuvieron una diferencia con
respecto al valor nominal inferior al 15%*.
• Exactitud: El error relativo en el rango fue inferior al 15%*.
• Precisión: El coeficiente de variación fue inferior al 15%*.
*(20% para el LOQ)
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> Grupo de trabajo :
• Hospital Quirón Torrevieja
• Belén Valenzuela
• Vanesa Escudero
• Servicio de proteómica del CI Príncipe Felipe
• Manuel M. Sánchez
• Luz Valero
• ainia Centro tecnológico
• Begoña Company
• Amelia Moreno
• Javier Miralles
> Trabajo financiado por :