O documento fornece um resumo sobre cromatografia gasosa, abordando sua definição, principais tipos, teorias e métodos. É descrito o princípio de separação dos componentes de uma amostra e os termos relacionados ao processo cromatográfico, como tempo de retenção e seletividade. Também são explicados conceitos sobre teoria dos pratos teóricos, resolução cromatográfica e principais detectores, com foco no detector por condutividade térmica.
2. DEFINIÇÃO
Conjunto de técnicas de separação cujo
princípio depende da distribuição
diferenciada dos componentes de uma
mistura entre duas fases, uma
considerada estacionária, e a outra,
móvel.
KROMA +
(COR)
GRAPH
(ESCREVER)
3. DEFINIÇÃO
Diferenças nas propriedades das fases móvel e
estacionária possibilitam com que os componentes da
amostra se desloquem através do material cromatográfico
com velocidades desiguais, gerando a separação
5. PRINCIPAIS FATOS HISTÓRICOS
1897-1903
David
Talbot Day
Separação
de HC do
petróleo
Separação de pigmentos;
proposição do termo
cromatografia
Mikhail Tswett
1903-1906
1930
Kuhn e Lederer
Cromatografia
em coluna
Cromatografia em
papel
Izmailov e Shraiber
1938
1941
Martin e Synge
Particição em
cromatografia
líquida;
Princípios de
fase gasosa
Primeira publicação
em fase gasosa
Martin e Synge
1952
1958
Egon Stahl
Cromatografia em
camada delgada
6. LÍQUIDA
CROMATOGRAFIA
PLANAR COLUNA
LÍQUIDA GÁS FLUÍDO
SUPERCRÍTICO
Líquida (CP)
Sólida (CCD)
Ligada (CCD)
Ligada (CSFL)
Sólido (CSS)
Líquida (CGL)
Sólida (CGS)
Ligada (CGFL) Líquida (CLL)
Sólida (CLS, CE)
Ligada (CFLF, CTI e CB)
7. TIPOS DE CROMATOGRAFIA
SIGLA NOME TIPO DE SEPARAÇÃO
CP Papel Partilha
CCD Camada Delgada Partilha
CCD-FL Camada Delgada com Fase Quimicamente
Ligada
Partilha e Adsorção
CGL Gás-Líquido Distribuição
CGS Gás-Sólido Adsorção
CGFL Gasosa com Fase Quimicamente Ligada Adsorção
CSS Sólida com Fase Móvel Super-crítica Adsorção
CSFL CSS com Fase Quimicamente Ligada Adsorção
CLL Líquido-Líquido Partilha
CLS Líquido-Sólido Adsorção
CE Exclusão Permeação
CLFL LíquidacomFaseQuimicamente Ligada Partilha e Adsorção
CTI Troca Iônica Interações Polares
CB Bioafinidade Bioatividade
8. TIPOS DE SEPARAÇÃO
Os princípios físico-químico básicos de separação
são:
Adsorção: O soluto é retido pela superfície da fase
estacionária através de interações químicas ou físicas.
Partição: O soluto se dissolve na parte líquida que envolve
a superfície do suporte sólido.
Troca iônica: O íon da amostra se liga à carga fixa
(grupo funcional) da fase estacionária.
Exclusão moléculas: As moléculas são separadas
por tamanho, havendo retenção das maiores.
Bioafinidade: Ocorre uma ligação molecular específica e
reversível entre o soluto e o ligante fixado à fase
estacionária.
16. ANÁLISE CROMATOGRÁFICA
Separação em colunas
convencionais
Considere a aplicação de
uma mistura de compostos
orgânicos no topo de uma
coluna cromatográfica
17. ANÁLISE CROMATOGRÁFICA
Separação em
colunas
convencionais
Estabelecida a percolação da FE
com o eluente (FM), os
componentes da mistura passarão
a migrar com velocidades desiguais
caso o sistema seja adequado para
a separação
18. ANÁLISE CROMATOGRÁFICA
Separação em colunas
convencionais
Uma boa seletividade
cromatográfica garantirá uma
boa separação entre os
componentes da amostra
19. ANÁLISE CROMATOGRÁFICA
Separação em
colunas
convencionais
Cada componente da amostra
poderá ser coletado isoladamente,
através de um coletor de frações
(neste caso, um simples frasco
coletor)
20. ANÁLISE CROMATOGRÁFICA
Separação em coluna
O monitoramento do eluato da coluna pode ser feito
através de um detector, cujo sinal identifica a “saída”
de cada componente da mistura, isoladamente
21. ANÁLISE CROMATOGRÁFICA
Separação em
coluna
A resposta do detector é
traduzida em um gráfico, ou
CROMATOGRAMA, que
relaciona o seu sinal com o
tempo necessário para a
eluição de cada
componente.
22. ANÁLISE CROMATOGRÁFICA
Separação em coluna
As moléculas de cada componente também migram
com velocidades desiguais devido a fenômenos de
difusão e transferência de massa
24. DEFINIÇÃO DE TERMOS
Tempo de retenção
O tempo gasto desde o ato
de injeção até a saída do
ponto máximo do pico do
sistema
O tempo de retenção
engloba todo o tempo que o
componente em questão fica
no sistema cromatográfico,
quer na fase móvel quer na
fase estacionária
25. DEFINIÇÃO DE TERMOS
Tempo de retenção
corrigido
Quando as moléculas do soluto
ficam na fase móvel, elas
devem movimentar-se com a
mesma velocidade das
moléculas da própria fase
móvel.
Parte do tempo em que as
moléculas do soluto estão na
fase móvel é igual ao tempo
gasto para as moléculas da fase
móvel percorrerem a coluna, tm
SENDO ASSIM, PARTE DO
TEMPO EM QUE AS
MOLÉCULAS DO SOLUTO
FICAM RETIDAS NA FASE
ESTACIONÁRIA É CALCULADA
PELA DIFERENÇA
26. DEFINIÇÃO DE TERMOS
Seletividade
Para a cromatografia
em coluna, o fator de
separação
(SELETIVIDADE) é
calculado pela razão
entre os respectivos
fatores de retenção
que, por sua vez, são
relacionados aos
tempos de retenção
corrigidos
29. MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
TEORIAS
Martin e Synge – Biochem. J. 35, 1358 (1941)
Meio descontínuo análogo às colunas de destilação
fracionada, constituído por um grande número de
estágios de equilíbrio ou PRATOS TEÓRICOS (TEORIA
DOS PRATOS TEÓRICOS)
Van Deemerter, Zuiderweg e Klinkenberg – Chem.
Eng. Sci. 5, 271 (1956)
Meio contínuo através do qual a separação ocorre por
fenômenos de difusão e transporte de massa (TEORIA
DA VELOCIDADE)
30. TEORIA DOS PRATOS
TEÓRICOS
Número de pratos teóricos
Coluna cromatográfica definida como uma série de estágios
independentes onde acontece um quase-equilíbrio entre o
analito dissolvido na fase estacionária (FE) e o gás de
arraste
31. TEORIA DOS PRATOS
TEÓRICOS
Número de pratos teóricos
O coeficiente Kc determina a distribuição da amostra (A)
entre as fases móvel (M) e estacionária (S) em um
determinado estágio do equilíbrio, obviamente hipotético.
Quanto mais efetiva for a presença de A na fase móvel (M)
menor será o seu tempo de retenção
39. DETECTORES
Definições Gerais
Dispositivos que geram um sinal elétrico
proporcional à quantidade eluída de um analito
~60 detectores já usados em CG
~15 equipam cromatógrafos comerciais
4 respondem pela maior parte das aplicações
Detector por Condutividade Térmica DCT
Detector por Ionização em Chama DIC
Detector por Captura de Elétrons DCE
Detector Espectrométrico de Massas EM
40. DETECTORES
Parâmetros Básicos de Desempenho
Quantidade Mínima Detectável
Massa de um analito que gera um pico com
altura igual a três vezes o nível de ruído
41. DETECTORES
Parâmetros Básicos de Desempenho
Limite de Detecção
Quantidade de analito que gera um pico com
S/N=3 e wb=1 unidade de tempo
42. DETECTORES
Parâmetros Básicos de Desempenho
Velocidade de Resposta
Tempo decorrido entre a entrada do analito
na cela do detector e a geração do sinal
elétrico
43. DETECTORES
Parâmetros Básicos de Desempenho
Sensibilidade
Relação entre o incremento de área do pico e o
incremento de massa do analito.
44. DETECTORES
Parâmetros Básicos de Desempenho
Faixa Linear Dinâmica
Intervalo de massas dentro do qual a
resposta do detector é linear
48. DETECTORES
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE
TÉRMICA
Configuração tradicional do DCT: bloco metálico com quatro
celas interligadas em par – por duas passa o efluente da
coluna e por duas, o gás de arraste puro
49. DETECTORES
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE
TÉRMICA
Quando da eluição de um composto com condutividade
térmica menor que a do gás de arraste puro:
50. DETECTORES
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE
TÉRMICA
Os filamentos do DCT são montados numa ponte de
Wheatstone que transforma a diferença de resistência quando
da eluição de amostra numa diferença de voltagem:
51. DETECTORES
CARACTERÍSTICAS OPERACIONAIS DO DCT
SELETIVIDADE: Observa-se sinal para qualquer
substância eluída diferente do gás de arraste =
UNIVERSAL
SENSIBILIDADE/LINEARIDADE: Dependendo da
configuração particular e do analito: QMD=0,4 ng a 1
ng com linearidade de 104 (ng = dezenas de g)
VAZÃO DO GÁS DE ARRASTE: O sinal é proporcional à
concentração do analito no gás de arraste que passa
pela cela de amostra
52. DETECTORES
Características
Operacionais do DCT
Natureza do Gás de
Arraste: Quanto maior a
diferença de Δ entre a
condutividade térmica do
gás de arraste puro, A, e
do analito X, MAIOR A
RESPOSTA.
Δ = A - X
Como ≈ 1/M
(M=massa molecular)
QUANTO MENOR A MASSA
MOLECULAR DO GÁS DE
ARRASTE, MAIOR A
RESPOSTA
53. DETECTORES
Características
Operacionais do DCT
FATORES DE RESPOSTA:
Quanto menor a
condutividade térmica do
analito, maior o sinal
Os fatores de resposta
dependem da
condutividade térmica
do analito
Quantidades iguais
de substâncias
diferentes geram
picos
cromatográficos com
áreas diferentes!!!
54. DETECTORES
Características Operacionais do DCT
TEMPERATURAS DE OPERAÇÃO: Quanto
maior a diferença entre a temperatura dos
filamentos e do bloco metálico maior a
resposta.
55. DETECTORES
APLICAÇÕES
Separação e
quantificação de
compostos que não
geram sinal em outros
detectores (gases
nobres, gases fixos)
Por ser um detector
NÃO-DESTRUTIVO, pode
ser usado em CG
preparativa ou detecção
seqüencial com dois
detectores em “tandem”.
59. DETECTORES
DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA
Região de quebra: Mistura dos gases, pré-
aquecimento, início da quebra das moléculas de
H2, O2 e outros analitos
Zona de reação: Reações exotérmicas com
produção e/ou consumo de radicais H, O, OH, HO2
(provenientes do H2), CH e C2 (proveniente do
analito) e íons CHO+ (analito)
Zona de incandescência: Emissão de luz por
decaimento de espécies excitadas: OH (luz UV), CH
e C2 (visível)
61. DETECTORES
Características
Operacionais do DIC
SELETIVIDADE: Seletivo
para substâncias que
contém ligações C-H em
sua estrutura química
Como virtualmente todas as
substâncias analisáveis por CG
são orgânicas, na PRÁTICA o
DIC é UNIVERSAL)
62. DETECTORES
Características Operacionais do DIC
SENSIBILIDADE/LINEARIDADE: QMD típicas = 10
pg a 100 pg com linearidade entre 107 e 108 (pg a
mg)
VAZÕES DE GASES: Além do gás de arraste, as
vazões de alimentação de ar (comburente) e
hidrogênio (combustível) devem ser otimizadas.
63. DETECTORES
Características Operacionais do DIC
TEMPERATURA DE OPERAÇÃO: O efeito
da temperatura sobre o sinal do DIC é
negligenciável.
TRATAMENTO DO SINAL: Por causa da
baixa magnitude da corrente elétrica
gerada (pA a nA), ela deve ser amplificada
para poder ser registrada.
64.
65. DETECTORES
Características Operacionais do DIC
FATORES DE RESPOSTA: O fator de resposta de um
determinado composto é aproximadamente proporcional ao
número de átomos de carbono. Presença de
heteroelementos diminui o fator de resposta.
66. DETECTORES
DETECTOR DE NITROGÊNIO-
FÓSFORO
Modificação do DIC altamente seletiva
para compostos orgânicos nitrogenados e
fosforados
67. DETECTORES
DETECTORES POR CAPTURA DE
ELÉTRONS
PRINCÍPIO: Supressão de um fluxo de elétrons lentos
(termais) causada pela sua absorção por espécies
eletrofílicas
71. DETECTORES
Características Operacionais do DCE
Polarização dos eletrodos: Vários modos de polarização
possíveis
VOLTAGEM CONSTANTE: Pouco usada modernamente
picos cromatográficos podem ser deformados
VOLTAGEM PULSADA: Menos anomalias elétricas
maior sensibilidade e linearidade
Temperatura do detector: Dependência do sinal com
temperatura de operação bastante significativa
Variação de ± 3 ºC na temperatura Erro ~10% na área dos
picos
Magnitude e sinal do erro depende do composto analisado!
TEMPERATURA DO DCE DEVE SER RIGOROSAMENTE
CONTROLADA
77. CROMATOGRAFIA GASOSA
Compostos voláteis de pontos de
ebulição de até 350 ºC e pesos
moleculares menores que 500
Compostos que possam produzir
derivados voláteis
Compostos termicamente estáveis na
condições de trabalho
85. CROMATOGRAFIA GASOSA
GÁS DE ARRASTE
FASE MÓVEL EM CG: NÃO interage com a amostra
– apenas a carrega através da coluna. Assim é
usualmente referida como gás de arraste
INERTE: Não deve reagir com a amostra, fase
estacionária ou superfícies do instrumento
PURO: Deve ser isento de impurezas que possam
degradar a fase estacionária
86. CROMATOGRAFIA GASOSA
Impurezas típicas em
gases e seus efeitos:
H2O, O2
oxida/hidrolisa algumas
FE, incompatíveis com
DCE
Hidrocarbonetos
ruído no sinal de DIC
91. CROMATOGRAFIA GASOSA
Dispositivos de Injeção de Amostra
Os dispositivos para injeção (INJETORES
ou VAPORIZADORES) devem prover meios
de introdução INSTANTÂNEA da amostra
na coluna cromatográfica
96. CROMATOGRAFIA GASOSA
SPLIT
Amostras concentradas onde a diluição com
solvente é impossível particularmente devido a
co-eluição
SPLITLESS
Amostras diluídas ou análise de traços
Análise em ampla faixa de ponto de ebulição
e polaridade
Adequado para análide de amostras
complexas (multicomponentes)
97. CROMATOGRAFIA GASOSA
Parâmetros de Injeção
TEMPERATURA DO INJETOR: Deve ser
suficientemente elevada para que a amostra
vaporize-se imediatamente, mas sem
decomposição
REGRA GERAL: Tinj=50 ºC acima da temperatura
de ebulição do componente menos volátil
VOLUME INJETADO: Depende do tipo de coluna
e do estado físico da amostra
Sólidos: convencionalmente
se dissolve em um solvente
adequado e injeta-se a
solução
101. CROMATOGRAFIA GASOSA
COLUNAS CROMATOGRÁFICAS
Coluna Empacotada
VANTAGENS
Simples preparação e uso
Tecnologia clássica
Grande número de fases líquidas
Capacidade alta e longa durabilidade
Usada para análise de gases com DCT
DESVANTAGENS
Número de pratos limitado
Exige controle da vazão da fase móvel
Análises relativamente demoradas
Baixa resolução para amostras
complexas
102. CROMATOGRAFIA GASOSA
Temperatura da Coluna
Além da interação da FE, o tempo que
um analito demora para percorrer a
coluna depende de sua PRESSÃO DE
VAPOR (p0)
104. CROMATOGRAFIA GASOSA
FORNO DA COLUNA
Características desejáveis de um forno:
Ampla faixa de temperatura de uso: Pelo
menos de Tamb até 400 ºC. Sistemas
criogênicos (T < Tamb) podem ser necessários
em casos especiais
Temperatura independente dos
demais módulos: Não deve ser
afetado pela temperatura do injetor e
detector
Temperatura uniforme em seu interior:
Sistemas de ventilação interna muito eficientes
para manter a temperatura homogênea em
todo forno
105. CROMATOGRAFIA GASOSA
FORNO DA COLUNA
Características desejáveis de um forno:
Fácil acesso à coluna: A operação de troca de
coluna pode ser freqüente
Aquecimento e resfriamento rápido: Importante
tanto em análises de rotina e durante o
desenvolvimento de metodologias analíticas
novas
Temperatura estável e reprodutível:A
temperatura deve ser mantida com precisão e
exatidão de ± 0,1 ºC
EM CROMATÓGRAFOS MODERNOS (DEPOIS DE 1980)
O CONTROLE DE TEMPERATURA DO FORNO É
TOTALMENTE OPERADO POR
MICROCOMPUTADORES
106. CROMATOGRAFIA GASOSA
Programação Linear de Temperatura
Misturas complexas (constituintes com
volatilidades muito diferentes) separadas
ISOTERMICAMENTE:
109. CROMATOGRAFIA GASOSA
DETECTORES: Dispositivos que
examinam continuamente o material eluído,
gerando sinal quando da passagem de
substâncias que não o gás de arraste
110. CROMATOGRAFIA GASOSA
DETECTORES MAIS IMPORTANTES:
Detector por condutividade térmica (DCT ou TCD):
Variação da condutividade térmica do gás de
arraste
Detector por Ionização de Chama (DIC ou FID):
Íons gerados durante a queima dos eluatos em
uma chama de H2 + ar
Detector por Captura de Elétrons (DCE ou ECD):
Supressão de corrente causada pela absorção de
elétrons por eluatos altamente eletrofílicos
112. CROMATOGRAFIA GASOSA
Características de uma FE ideal
SELETIVA: Deve interagir diferencialmente
com os componentes da amostra
REGRA GERAL: A FE deve ter
características tanto quanto
possível próximas das dos
solutos a serem separados
(polar, apolar, aromático...)
113. CROMATOGRAFIA GASOSA
Características de uma FE ideal
AMPLA FAIXA DE TEMPERATURAS DE USO:
Maior flexibilidade na otimização da separação
BOA ESTABILIDADE QUÍMICAE TÉRMICA: Maior
durabilidade da coluna, não reage com
componentes da amostra
POUCA VISCOSIDADE: Colunas mais eficientes
(menor resistência à transferência do analito entre
fases)
DISPONÍVEL EM ELEVA
DO GRAU DE PUREZA:
Colunas reprodutíveis; ausência de picos
“fantasma” nos cromatogramas
114. CROMATOGRAFIA GASOSA
FASES ESTACIONÁRIAS SÓLIDAS:
ADSORÇÃO
O fenômeno físico-químico responsável pela
interação do analito + FE sólida é a ADSORÇÃO
A adsorção ocorre na interface entre o gás de arraste e a FE sólida
118. CROMATOGRAFIA GASOSA
FASES ESTACIONÁRIAS LÍQUIDAS:
ABSORÇÃO
O fenômeno físico-químico responsável pela
interação do analito + FE sólida é a ABSORÇÃO
A ABSORÇÃO OCORRE NO INTERIOR DO FILME DE FE LÍQUIDA
(FENÔMENO INTRAFACIAL)
127. CROMATOGRAFIA GASOSA
COLUNAS EMPACOTADAS
Tubo de material inerte recheado com FE sólida
granulada ou FE líquida depositada sobre um
suporte sólido
131. CROMATOGRAFIA GASOSA
ANÁLISE QUANTITATIVA
Duas metodologias:
Métodos por normalização
Métodos absolutos
MÉTODOS POR NORMALIZAÇÃO
*Assume-se que todos os componentes da amostra eluem da coluna
e são detectáveis
Existem dois procedimentos:
Normalização de área (% em área)
Normalização utilizando-se a área corrigida
132. CROMATOGRAFIA GASOSA
ANÁLISE QUANTITATIVA
Métodos por normalização
Normalização de área (% em área)
Ai = área do composto i
ΣAi = somatória das áreas de todos componentes
Considera-se que todos os componente apresentam
resposta proporcional à sua concentração e que mesma
concentração de diferentes compostos resulte em áreas
iguais (o que dificilmente ocorre).
133. CROMATOGRAFIA GASOSA
Normalização com área corrigida
onde Fi= Ci/Ai do componente i na mistura padrão
Ai = área do composto i
Fi = fator de resposta do componente i
ΣAiFi = somatória das áreas de todos componentes multiplicadas
pelos respectivos fatores de resposta
É necessário conhecer todos os componentes da amostra para
determinação dos fatores de resposta de cada componente
134. CROMATOGRAFIA GASOSA
Métodos absolutos
Utiliza-se métodos absolutos quando:
O objetivo da análise é quantificar um ou alguns dos componentes da
amostra.
Ao utilizar detectores específicos ou seletivos que detectam somente os
componentes de interesse
Existência de compostos na amostra que não são eluídos nas condições
de análise ou não são detectados e que não haja interesse de quantificá-
los.
Quantificação de componentes em baixa concentração.
Existem dois procedimentos:
Padronização externa
Padronização interna
135. CROMATOGRAFIA GASOSA
Métodos absolutos - Padronização externa
1. Determina-se a curva de calibração de cada componente através da
análise de misturas padrões injetando-se um determinado volume;
2. Posteriormente, injeta-se o mesmo volume da amostra e obtém-se a
concentração do analito através da curva de calibração.
Nesta técnica, se o volume injetado não for exatamente o mesmo ou se houver
alteração de algum parâmetro que afete a resposta do componente no detector,
como por exemplo, variação da intensidade de luz do UV-VIS ou alteração na FM, as
áreas dos picos poderão ser maiores ou menores daquelas obtidas na calibração e
consequentemente os resultados serão incorretos.
136. CROMATOGRAFIA GASOSA
Métodos absolutos - Padronização interna
Para minimizar os problemas da padronização externa, a amostra e a
mistura padrão são modificadas pela adição de um composto
considerado como padrão interno. O padrão interno deve ter as
seguintes características:
1. Não estar presente na amostra original, ser estável e não reativa.
2. Pico separado dos componentes da amostra
3. Eluir próximo dos componentes de interesse
4. Detecção semelhante dos picos de interesse
5. Concentração que produza área similar aos picos analisados
6. Pureza elevada ou conhecida (possíveis impurezas não devem eluir
com os picos de interesse).
137. CROMATOGRAFIA GASOSA
Métodos absolutos - Padronização interna
1. Determina-se a curva de calibração de cada componente através da análise de
misturas padrões contendo o padrão interno. Nessa curva de calibração utiliza-se a
relação entre área do componente i e área do padrão interno em função das relações
de suas concentrações.
2. Posteriormente, injeta-se a amostra contendo padrão interno (preferencialmente na
mesma concentração utilizada na calibração) e obtem-se a concentração do analito
através da curva de calibração.
Se o volume de amostra injetado for diferente do utilizado na calibração, ou se algum
parâmetro analítico for alterado resultando em áreas diferentes daquelas esperadas nas
condições de calibração, a relação de área entre analito e padrão interno não será
afetada.
Calculo da concentração via Padrão Interno:
Conc.% = area analito x FR x massa P.I(g) x100
area do P.I massa Amt (g)