Una guía sobre CRISP-Cas9, basada en la metodología POGIL.. Se han incluido 3 modelos. Los estudiantes deben trabajar en pequeños grupos usando esta guía, la cual presenta modelos gráficos e información de textos, seguidos por preguntas orientadoras diseñadas para guiar a los estudiantes en la formulación de sus propias conclusiones. El docente actúa como líder, facilitador, evaluador, trabajando con los grupos de estudiantes cuando necesitan ayuda.

1. CRISPR-Cas9 Edición del genoma
¿Cómo se usan los componentes de la inmunidad adaptativa
de procariotas para editar genomas?
¿Por qué?
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Antes de comenzar: Deberías poder describir el papel del sistema CRISPR-
Cas9 en la inmunidad adaptativa de procariotas. Se recomienda completar la
actividad de inmunidad de procariotas antes de esta actividad.
1. Revisión de la inmunidad de procariotas: Divida las preguntas siguientes entre los
miembros del equipo. Cada miembro del equipo debe trabajar individualmente para
escribir 2-3 oraciones en respuesta a sus 1-2 preguntas. Tómese unos minutos para
compartir las respuestas una vez que todos hayan terminado de escribir
a) Definir el término inmunidad innata
b) Definir el término inmunidad adaptativa
d) ¿Qué tienen en común las respuestas inmune de procariotas innatas y adaptativas?
La edición genómica es una técnica que permite a los científicos cambiar el DNA de un organismo. La edición
genómica CRISPR-Cas9 usa componentes del sistema inmune adaptativo procariótico para cortar DNA blanco
específicos dentro de una célula. Luego, la propia maquinaria de reparación del DNA celular cura el corte
haciendo una inserción o deleción o incorporando un nuevo segmento de DNA en el sitio del corte. Los enfoques
de edición del genoma CRISPR-Cas9 se han usado para muchas aplicaciones biotecnológicas, incluida la
fabricación de productos agrícolas resistentes y el diseño de terapias para enfermedades hereditarias.
c) ¿Cuáles son las diferencias entre la inmunidad procariota innata y adaptativa?
1

2. f) ¿Cuál es el papel de la nucleasa Cas9 en la respuesta inmune adaptativa de
procariota?
Modelo 1 – La edición genómica CRISPR-Cas9 requiere de una
rotura determinada de la doble cadena de DNA generada por la
endonucleasa Cas9.
2. En el Modelo 1, ¿qué introduce un científico en una célula para realizar la
edición del genoma mediante CRISPR-Cas9?
e) ¿Cuál es la función del ARN guía (gRNA o ARNg) en la respuesta inmune
adaptativa de procariotas?
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3. 3. Examina los componentes de la edición del genoma CRISPR-Cas9 del Modelo 1.
c) ¿Cuál es la función de la nucleasa Cas9?
A. crRNA B. tracrRNA
A. crRNA B. tracrRNA
4. El gRNA es una molécula singular diseñada “a la medida” por científicos para
contener los dos componentes naturales del RNA guía (gRNA) utilizado por los
procariotas: crRNA y tracrRNA (trans-activating CRISPR RNA; pronunciado “tracer
RNA"). El gRNA guía y le señaliza a la proteína Cas9 la posición de la secuencia del
DNA a modificar mientras que Cas9 es la que induce un doble corte en el DNA celular.
Responde las siguientes preguntas sobre gRNA según su conocimiento de la
inmunidad adaptativa procariota.
a) ¿Cuál componente del gRNA se requiere para unirse a la nucleasa Cas9?
b) ¿Cuál componente del gRNA se requiere para dirigir la nucleasa Cas9 hacia
un blanco específico del genoma?
c) ¿Cómo reconoce el gRNA un blanco específico en el genoma?
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a) ¿Qué partes (son dos) componen el ARN guía (gRNA)?
b) ¿Con qué enzima interactúa el gRNA?

4. 5. Primero, responde las siguientes preguntas sobre gRNA individualmente. A
continuación, compara tus respuestas con las de tus compañeros de equipo. Luego,
el encargado de redacción de tu equipo escribirá las respuestas consensuadas del
equipo a estas preguntas.
a) ¿Cómo podría un tipo dado de gRNA reconocer y unirse a múltiples
ubicaciones en el genoma?
b) ¿Cuál es la consecuencia cuando un gRNA reconoce múltiples blancos del
genoma?
c) Al diseñar un gRNA, ¿qué pueden hacer los científicos para minimizar la
posibilidad de que un gRNA reconozca sitios no deseados dentro del genoma?
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5. 6. La reacción catalizada por la enzima nucleasa Cas9 produce daños en el ADN.
a) Sobre la base de tu conocimiento de la inmunidad, ¿por qué el sistema
inmunológico adaptativo procariota utiliza una enzima que daña el ADN?
b) ¿Qué tipo de daño en el ADN cataliza la enzima endonucleasa Cas9?
A. Induce roturas monocatenarias (en una sola hebra) en el ADN
B. Rompe un enlace covalente en dos bases adyacentes en una hebra de AD
N
C.Induce roturas bicatenarias de ADN (rotura en las dos hebras
)
D. Provoca un cambio en la forma de una base nitrogenada del ADN.
c) Las roturas bicatenarias del ADN son particularmente peligrosas para una célula.
Individualmente, tómate un momento para considerar por qué son dañinas las
roturas bicatenarias del ADN. A continuación, comparte con tu grupo las respuestas
que diste. A continuación, el redactor del equipo enumerará todas las respuestas del
equipo.
¡Lee esto
Las roturas bicatenarias del ADN son causadas por factores intrínsecos, incluidos los
subproductos metabólicos como las especies reactivas de oxígeno y factores extrínsecos, por ej.,
radiación ionizante y algunos medicamentos contra el cáncer. La acumulación de estas graves
lesiones en el ADN conduce finalmente a apoptosis. En las células, han evolucionado dos sistemas
para reparar rápidamente las roturas bicatenarias del ADN. (1) La unión de extremos no
homólogos (NHEJ) y (2) la reparación dirigida por homología (HDR). CRISPR-Cas9 aprovecha
estos mecanismos de reparación del ADN para eliminar por completo o cambiar la función de
los genes blanco.
https://montoliu.naukas.com/2019/10/06/el-azar-como-terapia/
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6. b) ¿Cuáles son los dos tipos de cambios que puede introducir el NHEJ al
ADN durante la reparación?
Modelo 2 – El corte de Cas9 conduce a la unión de extremos
no homólogos (NHEJ) para editar el genoma.
a) ¿Cómo se generó la rotura del ADN bicatenario?
7. En el modelo 2, examina el proceso de reparación del ADN de la unión de extremos no
homólogos (NHEJ).
https://www.youtube.com/watch?v=J_O90G0VqYE&t=11s
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7. 8. NHEJ es un mecanismo de reparación del ADN que vuelve a unir los extremos de dos
moléculas de ADN. Para la salud de la célula, la necesidad de reparar rápidamente las
roturas bicatenarias del ADN compensa la inexactitud del proceso de reparación del ADN
mediante NHEJ. ¿Por qué NHEJ se considera un mecanismo de reparación del ADN
inexacto?
9. Considera el uso del término "homólogo" en el nombre, unión de extremos no
homólogos (NHEJ).
.
a
b) Compara tu definición con la de tus compañeros de equipo y decidan cuál es la
mejor. A continuación, el redactor de tu equipo debe escribir la mejor definición.
a) De forma individual, define el término homólogo de acuerdo a cómo es
usado el término en genética y biología molecular: “secuencias de ADN
homólogas”, “Homología de secuencias de ADN”
http://vis.usal.es/rodrigo/documentos/bioinfo/temas/3_Alineamientos%20de%20pares.pdf
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8. d) Basado en sus definiciones en las partes “a” y “b”, ¿por qué se dice que NHEJ
es un mecanismo de reparación del ADN no dependiente de homología?
10. Utiliza la edición del genoma CRISPR-Cas9 dependiente de NHEJ para estudiar la
función de un gen recién descubierto
a) Imagina que insertas un solo nucleótido en la región codificadora de proteínas
del gen. ¿La función del gen se verá afectada por la adición de este nucleótido?
Fundamente tu respuesta, independientemente si fue positiva o negativa.
b) Imagina que eliminaste un solo nucleótido del mismo sitio en la región codificadora
de proteínas descrita en la parte "a". ¿La función del gen se verá afectada por la
eliminación de este nucleótido? Fundamente tu respuesta, independientemente si fue
positiva o negativa
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9. c) ¿La respuesta que diste a la parte "a" es diferente a la de la parte "b"? ¿Por qué
o por qué no?
11. Con la edición del genoma mediante la herramienta biotecnológica CRISPR-Cas9
dependiente de NHEJ, se elimina una parte de una región reguladora necesaria para la
transcripción de un gen en estudio.
a) Individualmente, reflexiona en lo siguiente: ¿puede usarse para determinar la
función del gen a un alelo de un gen que está transcripcionalmente silenciado, es
decir, un alelo cuya función está anulada o inactiva? ¿Por qué o por qué no?
b) Compara tu respuesta con la de tus compañeros de equipo. ¿Todos dieron
respuestas similares?
c) Si las respuestas de los miembros del equipo que dieron a la parte “a” fueron
diferentes, ¿Qué llevó a los miembros de su equipo a sacar conclusiones
diferentes? A continuación, toma nota de eso.
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10. a
d) Planteas una hipótesis de que el gen en estudio es necesario para la
migración celular. Como grupo, describe cómo se puede usar un alelo cuya
función está anulada para confirmar o rechazar esta hipótesis.
12. En el Modelo 3, se prepara una molécula de ADN sintético para integrar un
nuevo segmento de ADN en el genoma de una célula.
Modelo 3: El corte de Cas9 dirige la inserción de un nuevo segmento de
ADN en el genoma mediante reparación dirigida por homología (HDR).
a) ¿Cuáles son los componentes de la molécula de ADN sintético?
https://www.youtube.com/watch?v=J_O90G0VqYE&t=11s
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11. 13. Para introducir un nuevo segmento de ADN en el genoma usando la edición
del genoma "CRISPR-Cas9 dependiente de HDR", ¿qué se debe introducir en la
célula junto con el ADN sintético?
14. Examina las definiciones del término "homología" en la pregunta 9, partes
"a" y "b". A continuación, revisa el proceso de reparación dirigida por homología
(HDR) en el Modelo 3. Basándote en tus definiciones de homología, ¿por qué
se hace referencia a HDR como un mecanismo de reparación del ADN
dependiente de homología?
15. Imagina que estás realizando un experimento para insertar un nuevo
segmento de ADN en un objetivo genómico. Sin embargo, cuando diseñaste tu
molécula de ADN sintético, se te olvidó agregar extremos homólogos a la
región objetivo deseada. Cuando introduces tu molécula de ADN sintético, el
gRNA y la nucleasa Cas9 en una célula:
a) ... ¿se integrará el nuevo segmento de ADN en la región diana del
genoma? ¿Por qué o por qué no?
b) ¿Qué características estructurales de la molécula de ADN sintético se
utilizan para integrar el nuevo segmento de ADN en la diana?
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12. b) ... ¿se realizarán cambios genéticos en el genoma? ¿Por qué o por qué no?
16. Los genes objetivos pueden modificarse o reemplazarse por completo
mediante la edición del genoma utilizando HDR. Como grupo, propongan
posibles razones por las que los científicos podrían querer:
a)… modificar la actividad de un gen de interés.
b)… reemplazar completamente un gen de interés.
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13. Preguntas de profundización
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17. La fibrosis quística (FQ) es una enfermedad hereditaria causada por
mutaciones en el gen regulador de la conductancia transmembrana de la
fibrosis quística (CFTR). La FQ es una enfermedad multisistémica de la
función de las glándulas exocrinas, cuya principal causa de muerte es la
infección de las vías respiratorias, que en última instancia conduce a
insuficiencia respiratoria
a) Como grupo, decidan cuál de las dos estrategias de “edición del
genoma CRISPR-Cas9” funcionaría mejor para reemplazar un alelo
causante de FQ con un alelo CFTR que no causa FQ en el genoma de
las células epiteliales de las vías respiratorias, ¿la dependiente de NHEJ
o de HDR? Explica tu respuesta.
b) Según el becario postdoctoral de la Universidad de Stanford, el Dr. Sriram
Vaidyanathan, “una terapia genética duradera para la fibrosis quística
necesitaría corregir las mutaciones que causan enfermedades en las células
madre de las vías respiratorias". (Khamsi, 2020) ¿Por qué se deben atacar
las células madre de las vías respiratorias mediante la técnica de edición del
genoma CRISPR-Cas9 para crear una terapia duradera?
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14. ​​
a) Como grupo, decidan si es más probable que se haya utilizado una
estrategia de edición del genoma CRISPR-Cas9 basada en NHEJ o
HDR para generar el hongo resistente al pardeamiento.
b) ¿Cómo puede ser modificada una estrategia de edición del genoma
CRISPR-Cas9 para generar deleciones en múltiples genes en el genoma del
hongo?
El Dr. Yinong Yang del Penn State College of Agricultural Sciences utilizó la edición
del genoma CRISPR-Cas9 para reducir la producción de una enzima que hace que
los hongos se vuelvan marrones. Este hongo resistente al pardeamiento tiene una
vida útil más larga y es resistente a los daños causados por la recolección y por la
manipulación. En 2016, el Departamento de Agricultura de EE. UU. confirmó que no
se requería una revisión regulatoria del hongo resistente al pardeamiento ya que no
contiene ADN extraño integrado en su genoma. En cambio, el hongo resistente al
pardeamiento tiene pequeñas deleciones en un alelo de un gen específico.
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