Métodos de secuenciación del DNA por generaciones

1. 1
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE YUCATÁN
Campus Ciencias de la Salud
Facultad de Química
Lic. En Químico Farmacéutico Biólogo
FARMACOGENÉTICA Y FARMACOGENÓMICA
ADA3: Secuenciación masiva
Equipo: 4
Alumnos
Br. Cool Méndez Carlos Alberto
Br. Encalada Salazar Rai
Br. Jiménez Becerra Daniel Eduardo
Mérida, Yucatán 23 de Junio 2017

2. 2
La secuenciación del ADN consiste en determinar el orden de las
bases A, C, G y T en un fragmento de ADN.
ATCGATCGATCGATCAGCTACGATCG
ATCGATCGATCGATCGATCAGCATCG
ATCGATCGATCGATCGATCGATCGAT
CGATCGATCGATCGATCGATCGATCG
ATCGATCGATCATTTATATTCTGCCGT
ACGACCTGACTGATCTGATCGAGTCG
ATCGACTACATATCGATCGATCGACG
ATCGTACGTATGCATGCGATCGTATCG
AGTCGTACTACGAGTCGACTGATCGT
AGTATATATGCAGCGATCGATGATCG
AGTCGATGTATTCTGACGCGATCTGA
GTCTGATGCCGTAGCAACGCTATGCT
ACTAGCTGACGTCATGCGTACGTAGT
CGTAGTACGTATCGATGCTGATGCAC

3. 3
Las bases de la
secuenciación de ADN
Principales tecnologías
de Secuenciación
Aplicaciones de la
secuenciación de ADN

4. 4
El impacto de las tecnologías de secuenciación masiva

5. 5
Allan M. Maxam y Walter Gilbert establecieron el proceso de
digestión química del DNA para determinar la secuencia de
nucleótidos del ADN.
3´
3´
5´
5´
3´5´
5´3´
Isótopo radioactivo (32P)
A y G Dimetil sulfato (DMS)
C y T Hidracina y Piperidina
Metilan
Trata

6. 6
Lectura de unas 100
bases de secuencias
Técnica de baja
resolución y en desuso

7. 7
Método de terminación de cadena o método Sanger (Frederick
Sanger)
Se basa en hacer cuatro reacciones diferentes de síntesis de ADN
utilizando la función propia de la ADN polimerasa y utilizando un
didesoxinucleótido (ddNTP)
ddNTP
no tiene un
grupo hidroxilo
en el 3´
Un dNTP
marcado con
32P

8. 8
Lectura de unas 300-500
nucleótidos
Una técnica mucho más eficiente en tiempo,
ejecución y sensibilidad de los resultados que
la de digestión enzimática

10. Conformado por equipos que emplean distintos métodos para la secuenciación con
un esquema de trabajo similar.
Tienen en común en que los amplicones de PCR derivados de cualquier molécula de
biblioteca única terminan agrupados espacialmente, ya sea en una única ubicación
en un sustrato plano o en la superficie de perlas de escala micrométrica.
Ventajas Desventajas
Construcción de librería y amplificación
in vitro sin el empleo de
microorganismos.
Longitudes de lectura más cortas que
en la secuenciación convencional.
La secuenciación basada en matriz tiene
un grado mucho más alto de
paralelismo en la lectura que la
secuenciación convencional.
Precisión en bruto diez veces menor al
convencional.
La inmovilización en una superficie
permite manipular enzimáticamente
con un único volumen de reactivo (Uso
de pL o fL).

11. 11
Muestra
ADN, ARN
Librería
Fragmentación
Ligación adaptadores
Librería Muestra
Single o paired-end
Secuenciación
Equipo Illumina,
Roche…
Reads NGS crudos
Formato fastQ o CS-FastQ
Informe experimento
Pasan/Fallan
Tasas error
Alineamiento
BWA, BFAST, Bowtie…
Secuencia de
referencia
Informe alineamiento
Reads y bases
alineados
Fichero BAM
Unir, ordenar y marcar
reads duplicados
Informe duplicados
Tasas duplicados y
únicos
Indexación fichero BAM
Reads alineados, no alineados
y duplicados

12. 12
fichero BAM
Indexado y con duplicados
marcados
Alineados
Distancia/orientación
correctas
Aberrantes
Distancia/orientación
inesperadas
No alineados
No alineados a la secuencia
referencia
SNPs y pequeñas
indels
Cambios de
número de copia
Detección de
VE/indels grandes
Variantes
estructurales
Nuevas
inserciones
Identificación

13. 13
Preparación del template
Secuenciación e imágenes
Terminación reversible cíclica
(CRT)
Adición de un solo nucléotido
(SNA) o pirosecuenciación
Secuenciación por ligación
(SBL)
ADN polimerasa
ADN polimerasa
ADN ligasa
Template amplificados
clonalmente
• Emulsión PCR
• Amplificación en fase
sólida (PCR Puente)
Templates de una sola
molécula
• Primer inmovilizado
• Template inmovilizado

14. 14
Pirosecuenciación
Emulsión PCR
Primer inmovilizado

15. 15
Preparación de la muestra
Extracción del ADN
Purificación del ADN
Fragmentación del ADN
La fragmentación se lleva a cabo mediante el proceso de tagmentación:
1. Combinación del transposoma con adaptador parcial y el ADN.
2. Fragmentación y adición del adaptador parcial por el transposoma.
3. PCR de ciclo limitado para añadir cebadores e indexes.

16. 16
Generación de clusters: Amplificación en fase sólida
Unión covalente de
cebadores directo e
inversos en el soporte
Se colocan los templates
que contienen la región
desconocida y adaptadores
Formación de la cadena
complementaria
Desnaturalización con
formamida de la doble
cadena
Amplificación del ADN con
PCR puente con ayuda de
cebadores inmóviles
Desnaturalización con
formamida de la doble
cadena
Formación de clusters
de cadena sencilla con
extremos libres
Densidad de amplificación
dependiente de la densidad
de cebadores

17. 17
Secuenciación: Terminación reversible cíclica
2. Adición de los 4 nucléotidos con marcadores
fluorescentes de diferente color.
4. Lavado y obtención de imagen de colores según el
nucleótido ensamblado
3. Incorporación de nucleótidos por la polimerasa.
5. Eliminación del marcador fluorescente de los
nucleótidos incorporados (regenera 3’-OH) con TCEP*
6. Lavado y adición de los 4 nucleótidos modificados
7. Continuación en Paso 3
1. Hibridación de cebador a secuencia universal del
tamplate
*TCEP: tris (2-carboxietil) fosfina (agente reductor)

19. 19
Tratamiento de datos
Alineamiento
o
ensamblado
Análisis de
los
resultados
De novo Resecuenciación

20. Características
Costo por Megabase: 2 dólares
Costo de equipo: 430,000 – 540,000 dólares
Longitud de lectura: 36 – 100 pb
Tiempo de corrida: 4 – 9 días
Tasa de error: 1 – 1.5% hasta <0.1%

21. Ventajas
• Plataforma más empleada actualmente
• Requiere de poca muestra (aprox. 1 ng)
• Bajo costo de secuenciación
• Numerosas aplicaciones
• Pocos requisitos de infraestructura
Desventajas
• Lento
• Multiplexación (combinación de señales)
• Capacidad de muestras
• Equipo costoso
• Laborioso
• Personal capacitado
• Mutaciones durante la amplificación
• Reducida eficiencia en la secuenciación dirigida a
regiones de interés
• Longitudes de lectura limitadas por factores que
causan la desintegración de señal y el desfasado

22. 22

23. 23

24. 24

25. 25

26. 26

27. 27

28. • La detección por citometría de secuenciación de ADN rápida basada en
la detección de moléculas simples: se basa en la detección de los fotones
emitidos por moléculas simples en un flujo laminar a su paso a través de
un haz concentrado de rayos laser. El espectro de emisión de los cuatro
marcadores fluorescentes, permite identificar a las cuatro bases.
• Lectura directa de secuencia de bases en la cadena de ADN mediante
microscopios de túnel de barrido.
• Análisis de la secuencia de ADN mediante espectrometría de masas.
• La secuenciación por hibridación sobre paneles de oligonucleótidos de
secuencia conocida

29. Secuenciación de moléculas de ADN individuales
nucleótido a nucleótido (Tecnología en desarrollo)

30. • El primer secuenciador de tercera generación lo
vende Helicos BioSciences
• Permite generar de forma fiable fragmentos de
entre 25 y 45 bases.
• Dada la pequeñez de las lecturas generadas, esta
tecnología está recomendada para la
resecuenciación de genomas y no para la
secuenciación de novo.
30

31. Equipo Compañía Método de
secuenciación
DNA
molde
Longitud
lecturas (pb)
Tiemp
o
carrera
Nt/carrera
(Gb)
Helicos
tSMS
Helicos
BioSciences
Polimerasa Molécula
única
25-45 192 37
Pacific
Bioscien
ces
Pacific
Biosciences
Polimerasa Molécula
única
1000 NA NA
ZX
Genetics
ZX Genetics Microscopia
electrónica
Molécula
única
NA NA NA

32. 32
Mide el efecto a nivel iónico y eléctrico del
paso de una hebra de ADN a través de un
nanoporo
Oxford Nanopore´s MinION
Ventajas
• Secuenciación individualizada
• Secuenciación de forma directa
• Lectura ultralarga (lectura de la longitud total)
• Económico
• Rápido
Desventajas
• Requiere gran cantidad de ADN
• Necesita secuenciar muchas moléculas únicas para
un consenso aceptable

33. 33
• Rodríguez, J. Secuenciación de genomas. Arbor. 2004, 698, 287-289.
• Maxam, A.; Gilbert, A. A new method for sequencing DNA. PNAS, 1977, 74, 2, 560-
564.
• Rodríguez, B.; Armengol, L. Tecnologías de secuenciación de nueva generación en
diagnóstico genético pre- y postnatal. Diagn. Prenat. 2012, 23, 2, 56 – 66.
• Shendure, J.; Ji, Hanlee. Next-generation DNA sequencing. Nature biotechnology.
2008, 26, 10, 1135 – 1145.
• Metzker, M. Sequencing technologies – the next generation. Nature Reviews. 2010,
11, 31 – 46.
• Technical Support Note: Sequencing. Illumina.
https://support.illumina.com/content/dam/illumina-
support/documents/documentation/chemistry_documentation/samplepreps_nexter
a/nextera-xt/nextera-xt-troubleshooting-guide.pdf (consultado junio 2017).
• Applied Biological Materials. https://www.abmgood.com (consultado junio 2017).
• Genética Médica Blog. http://revistageneticamedica.com/blog/secuenciacion-
tercera-generacion/ (consultado junio 2017).
• Romero, C. Genética Humana, 1 ed.; Bilvao: España, 1995; 47-49.
• Bautista, R. Las tres generaciones de la secuenciación. Universidad de Málaga. 2010,
3, 128