Uso do PRP no tratamento da osteoartrite equina
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O documento discute o uso do plasma rico em plaquetas no tratamento da osteoartrite equina. Apresenta os conceitos básicos sobre plaquetas e sua ativação, a obtenção e classificação do plasma rico em plaquetas, e os protocolos de centrifugação e ativação. Discutem-se também os fatores intrínsecos, a contaminação bacteriana e os resultados do uso do plasma rico em plaquetas no tratamento da osteoartrite. Finalmente, apresentam-se as perspectivas futuras da terapia e considerações finais.
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- 1. PLASMA RICO EM PLAQUETAS E SEU USO NA OSTEOARTRITE EQUINA Mestrando: Pedro Augusto Cordeiro Borges Orientador: Prof. Dr. Rogério Elias Rabelo Comitê de Orientação: Prof.ª Dr.ª Luciana Gaston Ramos Brandstetter – EVZ/UFG Prof.ª Dr.ª Maria Clorinda Soares Fioravantti – EVZ/UFG
- 2. Introdução Limites Fisiológicos Exigências Competitivas 2 Fonte: Raquel Albernaz (Borges et al, 2015)
- 3. Introdução 3 DEGENERAÇÃO SINOVITE REMODELAÇÃO OSTEÓFITOS (Goodrich & Nixon, 2006; Pichereau et al, 2014; Vendruscolo et al, 2014) Fonte: Adaptado de Mcllwraith, 2011Fonte: Lisa Lary, 2015 Fonte: www.curapelanatureza.com Fonte: www.horseclinic.com
- 4. Introdução 4 REPARAÇÃO REGENERAÇÃO AINE’S ESTEROIDAIS HA PRP MSC ACS (Kon et al, 2013; Broeckx et al, 2014)
- 5. Introdução 5 AUTOLÓGO INTRÍNSECOS EXTRÍNSECOS Fonte: Textor & David Gusmão Fonte: ProStride® (Giraldo et al, 2013; Vendruscolo et al, 2014)
- 6. Objetivo 6 Conceitos Influência de diferentes fatores Avanços na terapia Fonte: www.giphy.com
- 7. Morfofisiologia das Plaquetas 7(Jurk et al, 2005; White, 2007; Vendruscolo et al, 2012) Fonte: Adaptado de McKenzie & Willians 2015 o Fragmentos anucleados o 50% do volume = grânulos o Atividades biológicas o Interesse clínico
- 8. Ativação plaquetária Plaqueta 8 Fonte: Adaptado de Bayer® (Castro et al, 2006; Geraldo et al, 2014)
- 9. Ativação plaquetária 9(Castro et al, 2006; Geraldo et al, 2014; Yun et al, 2016) Fonte: Adaptado de Bayer®
- 10. Trombina Prot. G Fosf. C DAGIP3 Ca+ Ativação plaquetária 10(Castro et al, 2006; Kickler et al, 2006; Cocco,2016) Fonte: Adaptado de Bayer®
- 11. Ativação plaquetária 11(Everts et al, 2006; Kcikler et al, 2006) Fonte: Adaptado de Bayer®
- 12. Trombina Fibrinogênio Fibrina Ativação plaquetária 12(Castro et al, 2006; Angiollo et al, 2010; Fritzma et al,2015) Fonte: Adaptado de Bayer®
- 13. Plasma Rico em Plaquetas 13 o Derivado sanguíneo autólogo o Década de 1990 o “Cola biológica” o Medicina Esportiva, Ortopedia, Cirurgia plástica e oftalmologia Fonte: Professional Golfers AssociationFonte: www.freepick.com (Dhillon et al, 2012; Zhu et al, 2013; Vendruscolo et al, 2014; McCarrel et al, 2014)
- 14. 14 Plasma Rico em Plaquetas Osteoartrite Laminite Desmite Tendinites Feridas Cutâneas Migração Proliferação Angiogenese Deposição de Matriz Cicatrização (Vendruscolo et al, 2012; Angelone et al, 2017)
- 15. 15 Fatores de crescimento Plasma Rico em Plaquetas PDGF TGF-β IGF-1 VEGF FGF EGF CTGF o Migração e divisão o Síntese de MEC e colágeno o Tecido cicatricial o Redução do catabolismo o TIMPs (Reyes et al, 2004; Goldring et al, 2006; Textor et al, 2011; Dhillon et al, 2012; Vendruscolo et al, 2012; Fantini et al, 2014)
- 16. 16 Classificação Plasma Rico em Plaquetas (Dohan Enrenfest et al, 2009; Dohan Enrenfest et al, 2014; Grimalt et al, 2017)
- 17. 17 Classificação Plasma Rico em Plaquetas Fonte: David Gusmão Fonte: www.dreamstime.com Fonte: ASNAN (Dohan Enrenfest et al, 2009)
- 18. 18 Classificação Plasma Rico em Plaquetas • Ausente de leucócitos • Rede de fibrina pouco densa P-PRP • Presença de leucócitos • Rede de fibrina pouco densa L-PRP • Ausente de leucócitos • Rede de fibrina densa P-PRF • Presença de leucócitos • Rede de fibrina densa L-PRF Fonte: International Online Stud Book (Dohan Enrenfest et al, 2009)
- 19. 19 Obtenção oDiferentes técnicas = diferentes produtos oPlasmaferese oCentrifugação Plasma Rico em Plaquetas (Efeoglu et al, 2004; Foster et al, 2009; Arnoczky et al, 2011; Arnockzy et al, 2015)
- 20. 20 Obtenção Plasma Rico em Plaquetas E-PET™ Pall V-PET™ ACP™ GPS™III (Tamimi et al, 2007; Georg et al 2010, Castelijnis et al, 2011; Vendruscolo et al, 2012; Hessel et al, 2015) o Sistema de tubos o Sistema de dupla seringa o Sistema de filtros
- 21. 21 Obtenção Plasma Rico em Plaquetas (Pereira et al, 2013; Carmona et al, 2015)
- 22. 22 Obtenção Plasma Rico em Plaquetas 18 1ª 2ª PPP PRP Leucócitos & hemácias Plasma (Arnozcky et al, 2011; Pereira et al, 2012; Vendruscolo et al, 2014)
- 23. 23 Obtenção Plasma Rico em Plaquetas Fonte: www.midiaboom.com (Lopez-Vidriero et al, 2010; Arnozcky et al, 2011; Textor et al, 2011; Moraes, 2013)
- 25. 25 Protocolo de centrifugação o50% de variação o3 a 5x a [] do SG oTecido e Espécie Plasma Rico em Plaquetas (Ross & Smith, 2006; Moraes, 2013; Vendruscolo, 2014) Fonte: www.depositphotos.com
- 26. 26 Protocolo de centrifugação Plasma Rico em Plaquetas Fonte: www.thehorse.com
- 27. 27 Protocolo de centrifugação Plasma Rico em Plaquetas Plaquetas & Leucócitos Força G Tempo Leucócitos (Vendruscolo et al, 2012)
- 28. 28 Protocolo de centrifugação Plasma Rico em Plaquetas (Gonshor et al, 2002; Vendruscolo et al, 2012; Fantini et al, 2014) Força G 120- 240- 480- 600- o Ativação precoce o Pellet de leucócitos Fonte: Benchmark Scientific
- 29. 29 Protocolo de centrifugação Plasma Rico em Plaquetas ForçaG Plaquetas
- 31. 31 Concentração de leucócitos o Sem consenso oAntimicrobianas & Fatores de crescimento oMMP’s, ERO’s & Citocinas o< Leucócitos = efeitos anabólicos Plasma Rico em Plaquetas Fonte: Hoof Explorer® (Moojin et al, 2008; Zimmermann et al, 2008; Kisiday et al, 2012; McCarrel et al, 2012; Sunderman et al, 2014)
- 32. 32 Concentração de leucócitos Plasma Rico em Plaquetas
- 33. 33 Concentração de leucócitos Plasma Rico em Plaquetas IL-1Ra HA IL-4 HA Fonte: TurboSquid.com (Rios et al, 2015)
- 34. 34 Concentração de leucócitos Plasma Rico em Plaquetas (Arnockzy et al, 2011) Avaliação Particular! Fonte: www.thehorse.com Fonte: www.vetguide.com
- 36. 36 Protocolos de ativação oAtivação liberação de fatores oEstudo “in vitro” oNão há consenso oTrombina bovina, gluconato e cloreto de cálcio, tromboplastina Plasma Rico em Plaquetas Fonte: www.meddletoneequine.com (Wrobleski et al, 2010; Textor et al, 2011; Textor et al, 2012, Vendruscolo et al, 2014)
- 37. 37 Protocolos de ativação Plasma Rico em Plaquetas CaCl2 Trombina PDGF TGF-β Baixo custo Fácil acesso Reação Dano articular (Clark et al, 2008; Textor et al, 2012)
- 38. 38 Protocolos de ativação Plasma Rico em Plaquetas Sem ativação CaCl2 10% Trombina o Ativadas o Ativação incerta o Repouso o Dano irreversível
- 39. 39 Protocolos de ativação Plasma Rico em Plaquetas Classificação morfológica das plaquetas P-PRP(%) CaCl2(%) Repouso 41 20 Ativação incerta 49 54 Ativadas 9 24 Dano irreversível 1 2 (Zandim et al, 2012)
- 41. 41 Fatores intrínsecos Plasma Rico em Plaquetas (Giraldo et al, 2013)
- 42. 42 Fatores intrínsecos Plasma Rico em Plaquetas Fonte: Pinterest PDGF TGF-β Fonte: www.dreamstime.com Fonte: www.depositphotos.com TGF-β (Wilmink et al, 2004; Giraldo et al, 2013)
- 44. 44 Anticoagulante Plasma Rico em Plaquetas EDTA Sódico Heparina ACD Fluoreto de Sódio Citrato Trissódico Citrato de Sódio (Lei et al, 2009; Giraldo et al, 2015; Amaral et al, 2016)
- 45. 45 Anticoagulante Plasma Rico em Plaquetas
- 47. 47 Contaminação bacteriana oAfecções musculoesqueléticas oIntra-articular & intra-tendinea oContaminação & Infecção Plasma Rico em Plaquetas Fonte: www.onboardsolutions.com (Carmona et al, 2007; Sutter et al, 2007; Arguelles et al, 2008; Fantini et al, 2014)
- 48. 48 Contaminação bacteriana Plasma Rico em Plaquetas
- 49. Uso do PRP na Osteoartrite 43
- 50. 50 Uso do PRP na Osteoartrite (Carmona et al, 2007; Xie et al, 2014)
- 51. 51 Uso do PRP na Osteoartrite o 1 ano o Osteoartrite o Sem tratamentos o Grau de claudicação (AAEP) o Efusão articular o 3 injeções o 15 dias de intervalo o Baixo nível de exercício Fonte: www.dreamstime.com (Carmona et al, 2007)
- 52. 52 Uso do PRP na Osteoartrite
- 53. 53 Uso do PRP na Osteoartrite 80% voltaram a atividade atlética (Pichereau et al, 2012)
- 54. 54 Uso do PRP na Osteoartrite Tecido cicatricial e fibras colágenas Menos recidiva Atuação sobre sinoviócitos Fonte: Pinterest (Anitua et al, 2007; Yamada et al, 2012)
- 55. 55 Uso do PRP na Osteoartrite Pró-inflamatórios o MMP-3 o PGE2 o IL-6 o TNF-α Anti-inflamatórios o IL-4 o IL-10 Fonte: www.3rfphotos.com (Pereira et al, 2013; Textor et al, 2013; Xie et al, 2014; Filardo et al, 2015)
- 56. 56 Perspectivas Futuras Associação com outras terapias Condrogênese e osteogênese Mecanismo não definido Amplo campo de pesquisa Fonte: InfoEscola (Zhu et al, 2013; Xie et al, 2014; Amelse et al, 2015)
- 57. 57 Osteoartrite maior causa de afastamento Terapias celulares – PRP Necessidade de padronização Possibilidade de pesquisas Terapia mais eficiente Considerações Finais
- 59. PLASMA RICO EM PLAQUETAS E SEU USO NA OSTEOARTRITE EQUINA Mestrando: Pedro Augusto Cordeiro Borges Orientador: Prof. Dr. Rogério Elias Rabelo Comitê de Orientação: Prof. Dr. Luciana Gaston Ramos Brandstetter – EVZ/UFG Prof. Dr. Maria Clorinda Soares Fioravantti – EVZ/UFG
Editor's Notes
- Os esportes equestres demandam do equino um elevado índice de desempenho, em virtude de exigências competitivas cada vez maiores. Em muitos casos, o tipo de esforço ao qual o animal é submetido excede os seus limites fisiológicos, o que o predispõe a diversos problemas de ordem musculoesquelética. Muitas das condições clínicas que atingem o equino atleta, além de gerar desconforto, fazem com que este mantenha-se afastado das atividades esportivas por um longo período ou mesmo de maneira definitiva, o que resulta em significativas perdas econômicas.
- Dentre as causas de afastamento dos equinos das atividades esportivas, a osteoartrite é a mais comum Esta enfermidade é caracterizada pela degeneração progressiva da cartilagem articular, remodelação subcondral, sinovite, formação de osteófitos e eventual perda da função do membro Apesar da diversidade de terapias disponíveis para o tratamento de tal afecção, muitas vezes o resultado obtido é insuficiente para permitir o retorno pleno do animal ao esporte
- Nos últimos anos uma nova abordagem terapêutica tem sido empregada no manejo da osteoartrite, marcada por uma transição da abordagem tradicional, focada no conceito de reparação e que visa apenas aliviar sintomas e promover melhora clínica, para uma abordagem focada na regeneração efetiva da articulação afetada Nesse campo particular, o papel desempenhado pelos derivados sanguíneos, especialmente pelo plasma rico em plaquetas (PRP), é de grande relevância
- O fato de ser uma modalidade terapêutica de caráter autólogo, o que a torna livre de restrições inerentes a produtos farmacológicos, favoreceu um significativo avanço e ganho de popularidade nos últimos dez anos. No entanto, também pelo fato de ser autólogo, há uma natureza individual a cada produto gerado; diversos fatores intrínsecos e extrínsecos podem influenciar na composição final do PRP e com isso ter implicação direta no seu uso
- Assim, a presente revisão tem por objetivo tornar clara a definição de conceitos acerca do PRP, discutir a influência de diferentes fatores sobre a sua composição e relatar os avanços inerentes ao uso dessa terapia no tratamento da osteoartrite equina.
- Para conhecer afundo o PRP é necessário ter um conhecimento básico acerca do seu principal fator que o compõe; as plaquetas As plaquetas são definidas como pequenos fragmentos citoplasmáticos anucleados, discoides, originados de megacariócitos da medula óssea e podem ser dividias em zona periférica, zona sol-gel, zona de organelas e sistema membranar. Cada uma dessas zonas detém estruturas que desempenham um papel importante e particular no funcionamento das plaquetas. A zona das organelas contem os grânulos alfa e densos que em conjunto podem representar até 50% do volume plaquetário total e são dotados de diversas proteínas que exercem importantes atividades biológicas. Os grânulos alpha contem inúmeros fatores de crescimento que atuam nos processos de reparação tecidual, e principalmente a eles se deve o interesse clínico nas plaquetas. Para que o conteúdo dos grânulos seja liberado e exerça sua função, entretanto, é necessário que haja a ativação plaquetária.
- A ativação plaquetária, que compreende um processo dinâmico, que envolve a adesão, agregação e secreção plaquetárias. Um bom modelo para entender como funciona a ativação plaquetária, é uma lesão de endotélio vascular Após a lesão do endotélio vascular, há migração de plaquetas ao local no intuito de promover hemostasia
- A adesão plaquetária inicia-se pela ligação da plaqueta ao colágeno, que é mediada pela interação do complexo glicoproteico GPIb-V-IX forma ativa, com o Fator de van Willebrand (FvW), que forma uma ponte entre o colágeno exposto e membrana da plaqueta
- Essa interação estimula a secreção de ADP, o que potencializa a adesão de outras plaquetas à superfície vascular, de tal maneira que uma monocamada de células, que cobrira todo o tecido exposto Agonistas plaquetários como a trombina, se ligam então a receptores especificos da membrana das plaquetas e induzem via proteína G, a formação de segundos menssageiros, o IP3 e o DAG O IP3 leva a um aumento do cálcio que proporciona a fosforilação da cadeia leve da miosina, o que permite a interação da miosina com a actina, promove contração e ocasiona mudança na forma plaquetária
- A plaqueta deixa seu formato discoide para apresentar pseudopódos salientes. Os grânulos centralizam e o conteúdo dos grânulos-a é secretado através do sistema canicular aberto que fica na zona periférica das plaquetas.
- Uma vez liberado os conteudos dos grânulos, adesão e agregação adicional serão estimuladas, fazendo com que as plaquetas se unam formando uma rede plaquetária Simultaneamente há um estimulo a produção de mais trombina, que ira clivar o fibrinogênio em fibrina mantendo a estabilidade dessa rede.
- O PRP é definido com um derivado do sangue autólogo que contém uma concentração de plaquetas acima de uma linha base pré-determinada e que pode ainda contar com uma quantidade variável de leucócitos e células sanguíneas As primeiras descrições do desenvolvimento e uso do PRP datam do início da década de 1990, momento em que a ciência se concentrava na busca de “colas biológicas”(ZHU et al., 2013). Evidenciou-se que o PRP apresentava propriedades que potencializavam o reparo ósseo, bem como possuía efeitos anti-inflamatórios e antibióticos; tais efeitos foram atribuídos às plaquetas(VENDRUSCOLO, CYNTHIA PRADO et al., 2014). A partir de então o uso do PRP tornou-se frequente no campo da medicina regenerativa, com aplicações que vão desde a medicina esportiva e ortopedia, até cirurgia plástica e oftalmologia(MCCARREL et al., 2014). A terapia com PRP ganhou ampla popularidade e aceitação de seu uso na medicina esportiva em 2009, quando noticiou-se que dois jogadores do Pittsburgh Steelers tiveram suas lesões no tornozelo tratadas com PRP, antes de vencerem o Super Bowl(DHILLON; SCHWARZ; MALONEY, 2012). Em 2010 noticiou-se também que o golfista tigger woods então numero 1 do mundo utilizou prp para acelerar a recuperação de uma lesão no joelho
- Na espécie equina, o PRP é estudado e aplicado no tratamento de diferentes afecções, como tendinites e desmites, osteoartrite, laminite e feridas cutâneas; com efeitos benéficos tanto quando utilizado isoladamente, como quando usado sinergicamente, onde já demostrou promoção de migração e proliferação celular, angiogênese e deposição de matriz e, com isso, melhora nos processos de cicatrização
- Como já mencionado, os efeitos terapêuticos do PRP são atribuídos aos fatores de crescimento contidos nos grânulos alpha Os fatores de crescimento constituem um grupo de polipeptídios, biologicamente ativos, que podem estimular a divisão, crescimento e diferenciação celulares Dentre os vários fatores de crescimento, se destacam, o TGF-β e o PDGF, que são os fatores presentes em maior quantidade nos grânulos-α das plaquetas Ambos atuam na estabilização do tecido danificado nas fases iniciais de reparo e induzem células mesenquimais e epiteliais locais a migrar, dividir e aumentar a síntese de matriz extracelular e colágeno, o que, por sua vez, leva à formação do tecido conjuntivo fibroso cicatricial. Atuam especificamente estimulando a mitose de osteoblastos e fibroblastos e podem ainda antagonizar os efeitos catabólicos das citocinas e outros componentes deletérios aos tecidos, especialmente a cartilagem articular, uma vez que exercem efeitos anabólicos. O TGF-B por exemplo estimula a produção de TIMPS TGF-β estimula a expressão de condrócitos e diferenciação condrogênica das células-tronco mesenquimais, bem como promove a deposição de matriz extracelular e reduz efeitos inibidores da IL-1 sobre a síntese de proteoglicanos. O PDGF leva a um aumento na proliferação dos condrócitos e síntese de proteoglicanos e o IGF, além de estimular a síntese de proteoglicanos, retarda a degradação desse componente da matriz
- Existe ainda uma certa falta de padrão quanto a nomenclatura, não há uma denominação universal que caracterize de maneira indistinta os concentrados plaquetários. Embora as pesquisas continuem evoluindo, uma classificação que seja clara e que defina de maneira única cada um dos concentrados plaquetários é importante afim de facilitar a interpretação dos resultados Um sistema de classificação proposto em 2009 foi considerado como um marco na terminologia das plaquetas e passou a ser amplamente citado e utilizado
- Esse sistema classificou os concentrados de plaquetas em quatro grandes famílias, com base no conteúdo celular, sobretudo na presença ou ausência de leucócitos e na arquitetura de fibrina
- 1) Plasma rico em plaquetas puro (P-PRP) ou PRP pobre em leucócitos- o produto obtido é ausente de leucócitos e após ativado apresenta uma rede de fibrina pouco densa; 2) Leucócitos e plasma rico em plaquetas (L-PRP)- contém leucócitos em pequena ou grande quantidade e uma rede de fibrina pouco densa após a ativação; 3) Plasma rico em fibrina puro (P-PRF)- não apresenta leucócitos e possui uma rede de fibrina de alta densidade; além disso, diferentemente do P-PRP e L-PRP, esse produto apresenta-se na forma de um gel ativado e, com isso, é impróprio para o uso injetável; 4) Leucócitos e plasma rico em fibrina (L-PRF)- apresenta quantidades variáveis de leucócitos e, assim como o anterior, é inviável para o uso injetável, uma vez que se apresenta na forma de um gel ativo com uma densa rede de fibrina; porém, em virtude dessa forte matriz de fibrina, pode ser manipulado como um material sólido e tem várias aplicabilidades Embora esse sistema venha sendo utilizado foi possível observar que trabalhos recentes com equinos fazem adaptações próprias dentro do sistema, dividindo o L-PRP por exemplo como Lc-PRP ou Lr-PRP.
- O PRP pode ser obtido a partir de diferentes técnicas, que podem levar a variações consideráveis na concentração final de plaquetas e, consequentemente, na disponibilidade de fatores de crescimento Inicialmente, a principal técnica para a obtenção do PRP era a plasmaferese, que se baseia na separação seletiva dos componentes sólidos e líquidos do sangue total, porém essa técnica, por exigir kits específicos e com isso torna-se mais onerosa, deu lugar a centrifugação, que é um método simples e de baixo custo, efetivo na obtenção de pequenas quantidades de prp.
- Além desses métodos, o PRP pode ainda ser obtido manualmente, por meio do sistema de tubos(TAMIMI et al., 2007), sistema de dupla seringa(GEORG et al., 2010) e sistema de filtros(CASTELIJNS et al., 2011). Existem ainda vários métodos comerciais disponíveis, que nada mais são a tecnificação de métodos manuais como a própria plasmaferese e a centrifugação, afim de tornar os resultados mais homogêneos.
- Para obtenção do PRP por centrifugação, o sangue autólogo é coletado, tomando-se todos os cuidados de antissepsia necessários; em tubos contendo anticoagulante afim de inibir a agregação plaquetária.
- Após isso pode se proceder uma ou duas centrifugações. Nos protocolos que utilizam duas centrifugações, a primeira tem o intuito de separar as células brancas e vermelhas das plaquetas, o que ocorre devido à diferença de densidade, enquanto que a segunda, geralmente com maior força gravitacional, resulta na obtenção de um sobrenadante pobre em plaquetas e uma fração rica em plaquetas.
- Por diferentes técnicas e protocolos de obtenção proporcionarem diferentes resultados no que concerne a quantidade de plaquetas e leucócitos, bem como disponibilidade de fatores de crescimento, e com isso influenciarem também no uso a qual o prp é destinado; a compreensão das diferenças ocasionadas pela tecnica, no produto final, é uma questão chave na decisão de qual protocolo utilizar. Diante disso, iremos discutir a seguir vários fatores que interferem na composição final do PRP bem como na maneira na qual esse é utilizado.
- A primeira dessas variáveis é a força de centrifugação Diferenças nas forças gravitacionais podem ocasionar variações de até 50% na concentração de plaquetas no produto final De modo geral, existe uma recomendação de que o PRP, para ser assim caracterizado, deve apresentar uma quantidade de plaquetas de três a cinco vezes superior à apresentada no sangue total. Tal afirmação, entretanto, é estendida da medicina e não considera diferenças existentes entre tecidos e espécies, portanto o protocolo a ser adotado e as características desejadas no produto final dependem do tecido e da espécie de interesse.
- Diante da vastidão de protocolos disponíveis, alguns estudos tem buscado comparar vários deles Um trabalho realizado por Venndruscolo et al, 2012, comparou as concentrações de leucócitos e plaquetas a partir de 10 diferentes protocolos de obtenção de PRP utilizando cinco equinos
- Os autores observaram que protocolos que utilizaram menor força de centrifugação permitiram obter maior concentração plaquetária e maior concentração de leucócitos. Quanto à relação tempo de centrifugação/concentração plaquetária, não houve diferença significativa entre os protocolos; porém, com o aumento do tempo de centrifugação observou-se redução na concentração de leucócitos Os autores definiram como melhor protocolo o proposto por carmona et al, 2007; que consiste de uma centrifugação a 120G e uma a 240G por 10 minutos
- Os autores definiram como melhor protocolo o proposto por carmona et al, 2007; que consiste de uma centrifugação a 120G e uma a 240G por 10 minutos Esses achados provavelmente se deram pelo fato de que forças de centrifugação mais altas podem ativar precocemente e/ou lesionar plaquetas, o que inviabiliza a obtenção de altas concentrações plaquetárias, ao mesmo tempo que promove a deposição de leucócitos no fundo do tubo e, com isso, leva à formação de um “pellet” de leucócitos que não é desfeito facilmente, o que resulta em uma menor concentração de leucócitos no produto final(VENDRUSCOLO, CYNTHIA P. et al., 2012).
- Um outro estudo, realizado por Pereira et al, 2012, comparou-se sete protocolos de obtenção de PRP, utilizando 10 equinos; todos com duas centrifugações e alguns deles com a metodologia adaptada, no que se refere ao volume sanguíneo, tipo de centrífuga e anticoagulante utilizado. Todos os protocolos permitiram obter um produto final com uma concentração de plaquetas 4x superior a do sangue total Os resultados corroboraram com o do estudo apresentado anteriormente no que se refere a concentração de leucócitos, uma vez que os protocolos com menor força e tempo de centrifugação apresentaram maior concentração de leucócitos Embora não tenha havido diferença estatística, os protocolos com maior força de centrifugação apresentaram melhor concentração plaquetária, o que difere do estudo anterior.
- A inclusão de leucócitos no PRP ainda é um tema sobre o qual não se tem um consenso, uma vez que há preocupação com o possível dano causado pelos leucócitos a tecidos viáveis no local de tratamento Ao mesmo tempo que os leucócitos estimulam a produção de fatores de crescimento e possuem propriedades antimicrobianas e restauradoras importantes no processo de reparação tecidual, também possuem características que potencializam o processo inflamatório, como aumento da expressão de MMPs, EROs e citocinas pró inflamatórias Estudos in vitro sugerem que o PRP com uma concentração baixa de leucócitos parece ser mais adequado ao uso no tratamento de lesões tendíneas e articulares, uma vez que essas preparações induzem a menos efeitos catabólicos e mais efeitos anabólicos do que as preparações ricas em leucócitos
- Outro estudo, que averiguou os efeitos pró-inflamatórios e anti-inflamatórios do P-PRP e L-PRP, pela mensuração do TNF- α, interleucina quatro (IL-4), antagonista do receptor da interleucina um (IL-1ra) e ácido hialurônico (HA) em SME de equinos previamente expostos a LPS
- Demonstrou que ambos os preparados apresentaram efeitos anabólicos com menores concentrações de TNF-α, quando comparados ao grupo controle. O L-PRP estimulou, em maior grau, a produção de IL- 1ra; porém, causou depressão significativa na produção de ácido hialurônico, enquanto que o P-PRP estimulou, de maneira contínua, a produção de IL-4 e HA, e apresentou os níveis mais baixos de TNF- α observados. Esse estudo sugeriu que a utilização de PRP com baixas concentrações de leucócitos pode ser mais favorável ao tratamento de afecções como sinovite e osteoartrite, por apresentar efeitos anabólicos mais evidentes
- Esse e outros estudos reforçam a ideia de que para uso intra-articular um PRP com menor concentração de leucócitos se faz mais interessante Contudo, é imprescindível não generalizar os efeitos positivos ou negativos da presença de leucócitos no PRP a todos os tecidos e condições clínicas, de tal maneira que uma avaliação particular do caso é necessária e tomada como principal critério de decisão ou não da inclusão de leucócitos no preparo do PRP
- para que as plaquetas liberem o conteúdo dos seus grânulos é necessário que sejam ativadas Um estudo “in vitro” demonstrou que, embora o PRP administrado sem ativação traga benefícios clínicos concretos, apenas uma fração dos fatores de crescimento nele contidos é liberada, o que leva à possibilidade de que uma abordagem padronizada para ativação do PRP possa levar a uma maior liberação de fatores de crescimento e, assim, a uma maior eficácia terapêutica Porém, a necessidade de ativação das plaquetas do PRP, previamente, concomitantemente ou posteriormente ao uso, ainda é fruto de diversas discussões e não se tem um consenso quanto ao momento ideal para ativação, nem mesmo quanto à necessidade ou não de realizar tal procedimento, o que faz com que a maioria dos clínicos use o PRP sem ativação Dentre os agentes ativadores mais frequentemente estudados estão a trombina bovina, a tromboplastina, o cloreto e o gluconato de cálcio
- Um estudo avaliou a influência de quatro diferentes métodos de ativação sobre algumas características do PRP, dentre elas, a liberação de PDGF e TGF-B; mostrou que as amostras ativadas com CaCl2 propiciaram maior liberação do PDGF do que os demais tratamentos e as amostras ativadas com trombina bovina apresentaram maior liberação de TGF-β. Diante desses resultados, os autores sugeriram que o CaCl2 é interessante para ativação exógena do PRP, uma vez que se trata de um método de baixo custo e fácil execução, que potencializa a liberação de fatores de crescimento Trabalhos têm demonstrado que a trombina bovina pode levar a reações imunomediadas em receptores humanos. Ainda, há autores que indicam um significativo potencial de injúria articular após administração do PRP ativado com esse materia
- Um trabalho realizado por Zandim et al (2012)(ZANDIM et al., 2012), por meio de microscopia eletrônica; comparou a concentração de plaquetas em repouso, ativadas, com ativação incerta, ou com dano irreversível; em amostras de PRP de equinos, sem ativação, ativadas com CaCl2 (10%), ou ativadas com trombina bovina. As amostras ativadas com trombina bovina apresentaram alto percentual de alterações morfológicas e, por isso, não foram incluídas nas classificações propostas pelo experimento.
- Esse estudo indica que a utilização de PRP sem ativação parece ser uma alternativa mais interessante à prática clínica, uma vez que já se tem uma quantidade considerável de plaquetas ativadas, bem como um percentual razoável de plaquetas em repouso, que passarão por posterior ativação e que, nos casos em que há necessidade da utilização do gel, a ativação seja preferencialmente realizada com CaCl2.
- Pouco são os trabalhos que avaliam ou demonstram a influencia de fatores inerentes ao individuo, como, raça, sexo e idade sobre o plasma rico em plaquetas; muito pelo N dos trabalhos Um estudo comparou o PRP obtido de Cavalos Criolos Comlobianos (CCH) e Cavalos Criolos Argentinos (ACH), quanto às concentrações de PDGF e TGF-β em diferentes concentrados de plaquetas.
- De modo geral, foi possível observar que os CCH apresentaram maiores concentrações de PDGF, quando comparados aos ACH. As fêmeas apresentaram maiores concentrações de TGF-β e os equinos com menos de cinco anos apresentaram maiores concentrações de TGF-β, do que aqueles com idade entre cinco e dez anos(GIRALDO et al., 2013). O CCH é uma raça do tipo pônei e os achados desse estudo podem sugerir que a maior concentração de PDGF, presente nas plaquetas desses animais, é um fator central da observação de que a cicatrização tecidual é mais rápida em pôneis do que em cavalos.
- Embora existam diversos anticoagulantes, aqueles que fornecem melhor suporte à separação das plaquetas, sem que haja prejuízos, são o ácido citrato dextrose (ACD) e o citrato de sódio. No entanto, há uma carência de informações, no que se refere ao efeito desses anticoagulantes sobre o conteúdo celular e a liberação de fatores de crescimento presentes no PRP equino Estudos em humanos já foram realizados, mas seus resultados são contraditórios, enquanto alguns autores hegaram à conclusão de que o ACD seria mais efetivo que o citrato de sódio, em propiciar a obtenção de um PRP com boa concentração de plaquetas e fatores de crescimento; outros autores demonstraram que o citrato propicia maior concentrado e influencia menos a expressão de genes que se multiplicados demaneira exarcerbada podem ocasionar problemas
- Um estudo realizado com equinos, que comparou os anticoagulantes citrato de sódio e ACD, quanto à influência sobre a contagem total de plaquetas e leucócitos, parâmetros de ativação de plaquetas e concentração dos fatores de crescimento PDGF e TGF-β no PRP, demonstrou não haver influência significativa correlacionada à escolha de um desses anticoagulantes sobre os fatores mencionados, para esta espécie Parametros da ativação plaquetária refere-se a alterações morfológicas das plaquetas (volume plaquetário médio e distribuição plaquetária no campo de visualização)
- Diante do interesse do uso do PRP no tratamento de afecções musculoesqueléticas, colocou-se em questão o risco de contaminação bacteriana durante a preparação desse produto, para a administração em estruturas sinoviais, uma vez que essas são extremamente susceptíveis à contaminação e infecção, o que pode ocasionar problemas graves
- Um estudo analisou o risco de contaminação bacteriana durante o processamento manual do PRP equino, desde a colheita até a obtenção do produto final, diante de três diferentes condições: com e sem câmara de fluxo laminar em um ambiente laboratorial limpo e com bico de Bunsen. Foram identificados pontos críticos como possíveis vetores de contaminação e realizadas culturas bacterianas. Os resultados mostraram que, uma vez em ambiente laboratorial limpo, não há necessidade de fluxo laminar para obtenção de um PRP asséptico e que a maior possibilidade de contaminação do material está relacionada a uma técnica de colheita de sangue sem os cuidados de antissepsia adequados Descrição semelhante foi feita em estudos que visavam o controle de qualidade de concentrados de plaquetas em humanos(WALTHER-WENKE et al., 2006).
- A melhora promovida pelo uso do PRP no tratamento da osteoartrite tem sido observada, tanto em equinos quanto em humanos(CARMONA, J. U. et al., 2007; ZHU et al., 2013). Os fatores de crescimento contidos no PRP podem promover a regeneração da cartilagem articular, uma vez que atuam diretamente sobre os condrócitos para favorecer a sua proliferação e diferenciação(XIE; ZHANG; TUAN, 2014).
- Um estudo piloto realizado em 2007 acompanhou a evolução clínica e ultrassonográfica de quatro equinos, de diferentes idades, sexos, raças e atividades esportivas, diagnosticados com osteoartrite e tratados com PRP intra-articular.
- Nesse estudo foram incluídos animais que apresentavam claudicação a pelo menos um ano, tendo o diagnóstico de osteoartrite sido confirmado por meio de exame radiográfico. Os animais encontravam-se em repouso que variou de 2 meses a 1 ano e não haviam recebido nenhum tratamento nos últimos três meses. Os animais foram avaliados quanto ao grau de claudicação recebendo um escore referente a graduação da AAEP e foi ainda atribuído um escore referente ao grau de efusão articular, com base em parâmetros estabelecidos no estudo Foram feitas três administrações do PRP, com intervalo de duas semanas entre elas. Após cada administração os animais foram avaliados clinicamente, bem como uma avaliação foi feita 2 meses após a ultima injeção de PRP. Após isso alguns animais voltaram ao treinamento em nível leve e outros no mesmo nível que competiam antes Foi possível observar uma significativa redução do grau de claudicação em todos os animais, principalmente dois meses após a terceira administração do PRP. Esse grau de claudicação final manteve-se estável por oito meses e, só então, alguns animais começaram a apresentar um aumento gradual na claudicação
- Pichereau et al (2014) avaliaram a eficácia do PRP no tratamento da osteoartrite de boleto em equinos. Foram utilizados 20 animais de enduro, que haviam sido tratados anteriormente com corticosteroides intra-articulares e repouso, sem alcançar resultados satisfatórios Nesse estudo foram utilizados animais que não haviam recebido nenhum tratamento a pelo menos 6 semanas O diagnostico de osteoartrite foi confirmado através do exame de claudicação e exames de imagem Três injeções intra-articulares de 3ml de PRP foram administradas, com intervalo de 15 dias entre elas e, no momento da artrocentese, uma amostra de líquido sinovial foi colhida para análise.
- Foi possível observar uma redução significativa nos níveis de IL-1 ao longo do tratamento, bem como uma redução considerável na claudicação, ao exame clínico, entre a segunda e a terceira administração do PRP. Em uma avaliação realizada um ano após o tratamento, 80% dos animais haviam retornado às suas atividades atléticas, com o mesmo nível de desempenho anterior, sem apresentar nenhum histórico de claudicação do membro tratado ao longo do ano
- Outros autores já demonstraram que o tratamento com PRP intra-articular em equinos promove melhor tecido cicatricial e melhor organização de fibras colágenas, bem como propicia menos recidiva em animais que voltam as atividades Um estudo “in vitro” em humanos demonstrou que o PRP é capaz de atuar sobre os sinoviócitos e, com isso, aumentar a produção de ácido hialurônico, o que promove um prolongado efeito analgésico e anti-inflamatório à articulação, o que corrobora com os achados de estudos clínicios realizados em equinos
- Apeasar de todos esses efeitos benéficos, o PRP administrado por via intra-articular também pode exercer efeitos pró-inflamátorios, como aumento da produção de MMP-1 e MMP-3 por sinoviócitos(FILARDO et al., 2015), aumento da liberação de prostaglandina E2 (PGE2) nas primeiras seis horas após a administração e aumento transitório das concentrações de IL-6 e TNF-α(TEXTOR, JAMIE A.; WILLITS; TABLIN, 2013). No entanto, estudos realizados em humanos comprovam que esse efeito pró-inflamatório é transitório e seguido de resolução espontânea e que, enquanto o aumento de citocinas pró-inflamátorias ocasionado pelo PRP é discreto, citocinas moduladoras como a IL-4 e IL-10, aumentam sua concentração em mais de cinco vezes
- Uma nova perspectiva para otimização do uso do PRP e obtenção de melhores resultados terapêuticos surgiu a partir da idealização de associar essa terapia a outras terapias celulares, principalmente a células-tronco. Um estudo realizado com cultivos celulares de células-tronco mesenquimais, derivadas da medula óssea de equinos, a adição do PRP resultou em incremento da condrogênese e osteogênese, o que torna claro que o PRP é capaz de melhorar a função de células multipotentes; porém, a maneira com que essa interação ocorre ainda não está definida, o que abre um campo para realização de pesquisas que venham a estabelecer, de maneira concisa, a relação entre essas duas terapias e prover diretrizes para o uso racional dessa associação