Tesi di Laurea In Chimica Industriale Indirizzo Organico e Biochimico. Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali dell'Università Di Roma Sapienza.

1. UNIVERSITÁ DEGLI STUDI DI ROMA
“SAPIENZA”
Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali
Corso di Laurea Triennale in Chimica Industriale
“PREPARAZIONE DI NANOGEL DI CHITOSANO
GALATTOSILATO PER RETICOLAZIONE IN MICELLE DI
COMPLESSI POLIIONICI”
TUTOR LAUREANDO
Prof. Giancarlo Masci Jacopo Cautela
Matr.1169538

2. Scopo della ricerca
Preparazione e caratterizzazione di nanogel di chitosano galattosilato (ChitGal)
di dimensioni inferiori a 100 nm a partire da micelle di complessi poliionici
(PIC).
• Degradazione del chitosano nativo (Mn=1,5x10^5 Da, DD=87%, pKa 6,5)
• Funzionalizzazione del chitosano degradato (Galattosilazione).
• Preparazione dei PIC mediante interazione tra il ChitGal e un copolimero a
blocchi ionico, carico negativamente (PEO-b-PAMPS)
• Reticolazione dei PIC con genipina
• Liberazione dei nanogel mediante l’aumento della forza ionica.
Genipina
Residui di
ChitGal

3. Nanogel
I nanogel sono reticoli tridimensionali idrofilici di dimensioni nanometriche in
grado di immagazzinare acqua, mantenendo inalterata la loro struttura.
Biocompatibilità
Biodegradazione
DIMENSIONI RIDOTTE (INFERIORI A
100 nm)
NOTEVOLE AREA SUPERFICIALE
RETICOLO INTERNO
per incorporamento di agenti
terapeutici
Hanno molte applicazioni in campo biomedico nel
trasporto di molecole bioattive e per il rilascio
controllato e mirato in cellule bersaglio.
Indirizzamento specifico dei
nanogel verso tessuti malati
salvaguardando i tessuti
sani.
Dimensioni inferiori
a 100 nm
consentono di ridurre
l’escrezione
renale.
Riduzione della frequenza e
quantità delle somministrazioni.

4. Chitosano
• Solubile a pH fisiologico
•Capacità di disperdere le
nanoparticelle
•Attività biologica intrinseca
Il residuo galattosilico di molte proteine plasmatiche viene riconosciuto dai
recettori asialoglicoproteici (ASGP-R) che le cellule epatiche presentano sulla
superficie. Tale residuo favorisce l’endocitosi delle molecole ad esso legate.
Proprietà
•Agente chelante
•Emulsionante
•Addensante
Impieghi nei settori
•Biomedicale
•Farmaceutico
•Alimentare
•Cosmetico
Vantaggi
•Polielettrolita
•Potenziali siti di legame
per fattori bioattivi
•Biocompatibile
•Processo estrattivo
semplice ed economico
ChitGal

5. Preparazione dei nanogel tramite nanoreattori PIC.
1. La metodologia è stata quella di utilizzare delle micelle di complessi poliionici
come nanoreattori, all’interno del quale far avvenire la reazione di
reticolazione per la creazione del nanogel.
2. La reticolazione avviene tra il solo reticolante e le catene di biopolimero
mentre il copolimero a blocchi rimane intrappolato all’interno del reticolo.
3. L’allontanamento del copolimero avviene per aumento della forza ionica
della soluzione e ha come risultato finale la presenza in soluzione di particelle
di nanogel di dimensioni inferiori ai 100nm.
Poli(etilenossido)114-b-poli-(2acrilammido-
2-metilpropansolfonato)x

6. Micelle di complessi poliionici (PIC)
Rapporto tra le lunghezze dei segmenti carichi nel nucleo delle
micelle (se non confrontabili si possono ottenere micelle grandi
con nucleo mal definito)
Forza ionica.
il rapporto molare tra le cariche
dei polimeri (f+ = è 0,5)
pH (completa ionizzazione di tutti i polimeri carichi.
FRAZIONE DI MESCOLAMENTO
Parametri che controllano la morfologia e la
dimensione dei PIC:

7. Degradazione del Chitosano
-0,5
-0,3
-0,1
0,1
0,3
0,5
0,7
0,9
1,1
20 25 30 35
V el (ml)
Intensitànormalizzata(mV)
Chitosano
Chit15 min
Chit60 min
Chit24 h
Chit44
Campione Mn
(104
Da)
Mw(104
Da)
I =Mn /
Mw
Xn
sperimentale
Chitpartenza 15.0 39.4 3.00 875
ChitDEG15minuti 10.5 28.2 2.68 701
ChitDEG30minuti 8.9 23.3 2.60 595
ChitDEG60minuti 4.2 12.9 3.25 280
ChitDEG230minuti 3.7 12.2 3.11 251
ChitDEG24h 3.3 10.9 3.08 200
Campione Mn (104
Da)
Mw(104
Da)
I =Mn /
Mw
Xn
Chitpartenza 13.1 39.4 3.00 875
ChitDEG15minuti 3.6 11.1 3.13 237
ChitDEG60minuti 1.8 4.22 2.37 119
ChitDEG24ore 0.71 2.4 3.34 48
y = -0.749x + 20.36
R² = 0.999
4
4.5
5
5.5
6
6.5
7
7.5
8
8.5
15 17 19 21 23
log[n]xM
vol rit (ml)
Xn (teorico) 40(Mn=7*103Da)
Retta di taratura (standard pullulano Sigma
Aldrich, Mw=0,58xDa, 1,12 x Da, 38xDa, 85xDa)
Xn (teorico) 160
Mn=1,5x10^5Da
La degradazione viene effettuata per ottenere
catene di polisaccaride di dimensioni
confrontabili con le catene di copolimero a
blocchi.
(Mn=3*104Da)

8. Sintesi del Chitosano galattosilato (ChitGal)
Amminazione riduttiva del chitosano per
reazione con lattosio .
•Chitosano + lattosio + NaBH3CN in 1:1
metanolo:AcOH 1% pH 4.5
• t = 5 giorni, T = 25 C
2
b
4
5
6,6’
7
8
9
8a
3
15 Spettri 1H-NMR di ChitGal53 e del Chitosano in D2O e 10% di acido acetico deuterato
a 87 C in concentrazione 10 mg/ml. In alto: figura del Chitgal con relativa assegnazione dei picchi.
.
100*
I(8)I(9)
I(9)
DD(%) 100*
I(8a)I(9)
I(8a)
DG(%)
Campione DGteor (%) DG sper (%)
ChitGal20 20 18
ChitGal40 40 20
ChitGal60 60 33
ChitGal80 80 46
ChitGal100 100 53
Percentuali di galattosilazione del chitosano

9. Preparazione dei PIC
CHITGAL
CHITGALCHITGAL
ChitGal
C
PE
V
n
COPOLIMERO
CHITGAL
copolimero
C
n
(ml)V COPOLIMEROPE
0
20
40
60
80
100
120
4 11 24 40 58 75 87 95 98 100
Dh (nm)
Intensitànormalizzata
Distribuzione del diametro idrodinamico ottenuto tramite
analisi CONTIN della micella PIC A20C40G20 in acido
acetico 0.05 M ad una concentrazione di 3 mg/ml e a T =
25˚C.
Campione Diametro idrodinamico (nm)
A20C40G20 53
A20C40G53 65
A40C40G20 51
A40C40G53 113
Campione f+ del chitosano Dh (nm)
A20C40G20 (a. acetico 0,05M) 0.5 51
A20C40G20 (a. acetico 0,05M) 0.4 67
A20C40G20 (acqua) 0.5 95
A20C40G20 (acqua) 0.4 124
acido acetico 0.05 M , concentrazioni di 3 mg/ml e f+ = 0.5.
PIC preparati in AcOH
0.05M, in concentrazione 3
mg/ml
++
La minore dimensione delle nanoparticelle
in acido acetico potrebbe in primo luogo
essere dovuta al pH della soluzione. La
dissociazione del chitosano è presso che
completa, ottimizzando l’interazione tra
cariche.

10. Immagine TEM del PIC A20C40G20

11. Dissociazione dei PIC, analisi DLS e ¹H-NMR
Andamento dell’intensità
diffusa in funzione della
concentrazione totale della
soluzione
Andamento del rapporto tra
l’integrale degli idrogeni in 2
del PEO e quello dei protoni
in 5 del PAMPS
0
20
40
60
80
100
120
140
0 0,2 0,4 0,6 0,8
C sale,tot (mol/l)
Intensitàdiffusa(kcps)
PIC A20C40G20
PIC A20C44
0
5
10
15
20
25
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
C sale, tot (mol/l)
IPEO/IPAMPS
CHITGAL
rapporto teorico
CHITOSANO

12. O
CH2OH OH
C
O OCH3
1
3
4
6 5
7
8
9
10
11
0
20
40
60
80
100
120
49 56 65 75 87
Dh (nm)
Intensitànormalizzata
Distribuzione del diametro idrodinamico
ottenuto tramite analisi CONTIN PIC A20C40G20
reticolata con genipina in rapporto molare 10:1
Campione reticolato Rapporto
Genipina:ChitGal
Dh(nm) prima
della reticolazione
Dh (nm) dopo la
reticolazione
A20C40G20 4:1 53 56
A20C40G20 10:1 53 52
A20C40G53 10:1 65 65
A40C40G20 10:1 51 53
A40C40G53 10:1 113 83
Analisi DLS dei reticolati
i diametri idrodinamici dei complessi poliionici
reticolati

13. 60
80
100
0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4
C sale, tot (mol/l)
Dh(nm)
Campione reticolato Rapporto molare
genipina : chitosano
Dh (nm)
dei nanogel
A20C40G20 4 : 1 100
A20C40G20 10 : 1 61
A20C40G53 10 : 1 78
A40C40G20
10 : 1 55
A40C40G53
10: 1 86
Le dimensioni dei nanogel sono superiori alle dimensioni dei PIC originari, poiché il reticolo
dell’idrogel si rigonfia come risultato della penetrazione dell’acqua tra le maglie.
Nanogel in soluzione
4:1
0
5
10
15
20
25
30
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
C sale, tot (mol/l)
IPEO/IPAMPS
rapporto teorico
nanogel di chitosano
nanogel di ChitGal

14. Immagine TEM dei nanogel di Chit40Gal20

15. Conclusioni
• Sono stati preparati nanogel di ChitGal a partire da complessi
poliionici.
• Misure di diffusione della luce e di microscopia elettronica hanno
dimostrato la formazione di particelle sferiche con bassa
polidispersione e dimensioni comprese fra 45 e 90 nm.
• Da quanto visto, Xn = 40, f+ = 0.5 e DG = 20%(teor.) sono i
parametri fondamentali per ottenere dei nanogel. Con le
caratteristiche richieste
Durante il tirocinio
• Ho acquisto le conoscenze necessarie per preparare dei nanogel
chitosano glattosilato a partire da micelle di complessi polionici.
• Ho inoltre acquisito le principali tecniche strumentali che sono state
necessarie per la caratterizzazione dei nanogel.

16. O
CH2OH OH
C
O OCH3
+ NH2R
OH
CH2OH
C
O OCH3
C NHR
N
CH2OH OH
C
O OCH3
R
O
CH2OH OH
C
O OCH3
+ NH2R
N
CH2OH OH
R
O
CH2OH OH
CO- OCH3
NH2
+
R
CO- OCH3
NHR
O
CH2OH OH
C
O NHR
+ CH3OH
1
2
Meccanismo di reticolazione della genipina

17. 11
PIC + genipina a t = 0
Genipina
3 7
1
10
9 5 6 6
PAMPS
O
CH2OH OH
C
O OCH3
1
3
4
6 5
7
8
9
10
11
PEO
Analisi ¹H-NMR della reazione di reticolazione dei PIC
PAMPS

18. 0
5
10
15
20
25
30
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
IPEO/IPAMPS
C sale, tot (mol/l)
rapporto teorico
nanogel di chitosano
nanogel di ChitGal
O C CH CH2
O
CH Cl
y
3 4
C O
N
C CH3H3C
H
5
6CH2
SO3Na
5
2
CH2O CH2
2
H3C
1
x
CH3
Nanogel reticolato senza
NaCl
Nanogel liberato
Genipina
ChitGal
PAMPS
Analisi ¹H-NMR della liberazione dei nanogel