ĐẶT VẤN ĐỀ Trong nền y học cổ truyền Ấn Độ Ayurveda, Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult) đã được sử dụng từ hơn 2000 năm nay để điều trị đái tháo đường [56], [61]. Dựa trên kinh nghiệm này, hàng loạt các nghiên cứu đã được tiến hành để chứng minh cơ chế tác dụng hạ đường huyết của cây và xác định các acid gymnemic là nhóm hoạt chất chính liên quan đến tác dụng này [49], [53]. Dựa trên nguyên lý là các loài cùng bậc taxon thực vật thường có các thành phần hóa học tương tự nhau do đó có xu hướng có tác dụng sinh học giống nhau [3], một số nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh được tác dụng hạ đường huyết tương tự trên các loài cùng chi như: Gymnema montanum Hook.f., Gymnema inodorum (Lour.) Decne, Gymnema yunnanense Tsiang,…[18], [40], [46], [47], [58]. Tại Việt Nam, các nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết mới được thực hiện trên chủ yếu 2 loài là Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult và Gymnema latifolium Wall. Ex Wight [12], [16]. Bên cạnh một số sản phẩm thực phẩm chức năng như Diabetna (Nam Dược), DK-betics (DK-Pharma),…còn rất nhiều trà thảo dược – dược liệu khô của dây thìa canh được bán rộng rãi cùng một số sản phẩm có tên gọi “Dây thìa canh” được sử dụng nhưng không thuộc hai loài đã nghiên cứu. Vì vậy, việc nghiên cứu sự đa dạng vân tay sắc ký TLC của một số loài thuộc chi Dây thìa canh giúp bước đầu phân biệt nhanh về hóa học, làm cơ sở cho việc kiểm nghiệm và sử dụng đúng các loài trong chi Gymnema R.Br.; đề tài “Nghiên cứu xây dựng vân tay sắc ký lớp mỏng của một số loài thuộc chi dây thìa canh - Gymnema R.Br” được thực hiện với các mục tiêu sau: - Xây dựng dấu vân tay sắc ký của một số loài thuộc chi Gymnema R.Br. bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao từ đó xây dựng cây phân loại dựa trên thành phần hóa học (sắc ký đồ) của các mẫu nghiên cứu. - Ứng dụng kết quả nghiên cứu phân tích sắc ký đồ của một số mẫu Dây thìa canh thu được trên thị trường.

1. BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN VIỆT CƯỜNG
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÂN TAY
SẮC KÝ LỚP MỎNG CỦA MỘT SỐ
LOÀI THUỘC CHI DÂY THÌA CANH
(Gymnema R.Br)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI – 2020

2. BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN VIỆT CƯỜNG
Mã sinh viên: 1501069
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÂN TAY
SẮC KÝ LỚP MỎNG CỦA MỘT SỐ
LOÀI THUỘC CHI DÂY THÌA CANH
(Gymnema R.Br)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
ThS. Phạm Thị Linh Giang
Nơi thực hiện:
Bộ môn Thực vật
Trường Đại học Dược Hà Nội
HÀ NỘI – 2020

3. Lời cảm ơn
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân
thành tới ThS. Phạm Thị Linh Giang, người đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ
bảo và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành
khóa luận này. Cô vừa là người thầy, vừa là người chị đi trước đã luôn động viên
và cho tôi những lời khuyên chân thành trong công tác nghiên cứu khoa học lẫn
trong cuộc sống, giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nhất có thể.
Bên cạnh đó, trong quá trình thực hiện khóa luận tôi còn nhận được sự
giúp đỡ và chỉ bảo của nhiều thầy cô, anh chị em khác. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn
tới:
PGS.TS Trần Văn Ơn, người thầy đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi thu
mẫu tại xã Yên Ninh, huyện Phú Lương, tỉnh Thái Nguyên và cho tôi những lời
khuyên quý báu trong nghiên cứu; các thầy cô giảng viên tại Bộ môn Thực vật:
TS. Hoàng Quỳnh Hoa, TS. Phạm Hà Thanh Tùng, ThS. Nghiêm Đức Trọng,
ThS. Lê Thiên Kim cùng các chị kỹ thuật viên đã luôn giúp đỡ, chỉ bảo nhiệt tình
cho tôi trong quá trình thực hiện khóa luận này.
Các em sinh viên nghiên cứu khoa học: Vương Thị Ngân Hà (A8K73),
Nguyễn Thị Ngọc Ánh (A3K72), Đinh Thùy Dương (A1K72) cùng các bạn thực
hiện khóa luận tốt nghiệp tại Bộ môn Thực vật, những người đã hỗ trợ tôi rất
nhiều trong thời gian nghiên cứu.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô và bạn bè tại Trường Đại
học Dược Hà Nội, những người tôi luôn học hỏi trong suốt 5 năm vừa qua.
Cuối cùng, tôi gửi lời tri ân đến gia đình tôi– nơi là chỗ dựa và nguồn động
lực mỗi khi tôi khó khăn.
Hà Nội, ngày 22 tháng 6 năm 2020
Nguyễn Việt Cường

4. MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .........................................................................................2
1.1. Chi Gymnema R. Br..............................................................................................2
1.1.1. Vị trí phân loại thực vật chi Gymnema R.Br. .................................................2
1.1.2. Đặc điểm thực vật, phân bố và các loài trong chi trên thế giới ......................2
1.1.3. Tác dụng sinh học của một số loài thuộc thuộc chi Gymnema R.Br..............3
1.2. Chi Gymnema R.Br. ở Việt Nam ..........................................................................3
1.2.1. Loài Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult ..........................................4
1.2.2. Loài Gymnema latifolium Wall. Ex Wight.....................................................6
1.2.3. Loài Gymnema inodorum (Lour.) Decne .......................................................8
1.2.4. Loài Gymnema yunnanense Tsiang................................................................9
1.3. Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao.....................................................10
1.3.1. Sắc ký lớp mỏng ...........................................................................................10
1.3.2. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao....................................................................10
1.4. Vân tay sắc ký thực vật .......................................................................................11
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................14
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị......................................................................................14
2.1.1. Mẫu nghiên cứu ............................................................................................14
2.1.2. Trang thiết bị nghiên cứu..............................................................................15
2.2. Nội dung nghiên cứu...........................................................................................16
2.2.1. Khảo sát một số thông số của quy trình phân tích vân tay sắc ký các mẫu
nghiên cứu...............................................................................................................16

5. 2.2.2. Xây dựng vân tay hóa học của một số loài thuộc chi Gymnema R.Br.........16
2.2.3. Xây dựng cây phân loại dựa trên thành phần hoá học (sắc ký đồ) của các mẫu
nghiên cứu...............................................................................................................16
2.2.4. Ứng dụng phân tích sắc ký đồ của một số mẫu Dây thìa canh thu được trên
thị trường ................................................................................................................17
2.3. Phương pháp nghiên cứu.....................................................................................17
2.3.1. Chuẩn bị mẫu phân tích ................................................................................17
2.3.2. Lựa chọn điều kiện triển khai sắc ký............................................................19
2.3.3. Tiến hành phân tích vân tay sắc ký các dịch chiết một số loài trong chi
Gymnema R.Br. theo quy trình đề xuất ..................................................................20
2.4. Phương pháp xử lý kết quả .................................................................................20
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM ..............................................................22
3.1. Kết quả khảo sát một số thông số của quy trình phân tích vân tay sắc ký các mẫu
nghiên cứu..................................................................................................................22
3.1.1. Với dịch chiết toàn phần...............................................................................22
3.1.2. Với dịch chiết sau thủy phân ........................................................................22
3.2. Kết quả xây dựng vân tay hóa học một số loài thuộc chi Gymnema R.Br. ........23
3.2.1. Với dịch chiết toàn phần...............................................................................23
3.2.2. Với dịch chiết sau thủy phân ........................................................................27
3.3. Kết quả xây dựng cây phân loại dựa trên kết quả sắc ký lớp mỏng của các mẫu
Gymnema nghiên cứu.................................................................................................31
3.4. Kết quả phân tích sắc ký đồ của một số mẫu Dây thìa canh thu được trên thị trường
....................................................................................................................................34
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN...........................................................................................37
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT.........................................................................................40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

6. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
H2SO4 Acid sulfuric
HCl Acid hydroclorid
HPTLC
High performance thin-layer chromatography – Sắc ký lớp
mỏng hiệu năng cao
ITS Internal Transcribed Spacer
KOH Kali hydoxid
MeOH Methanol
G. inodorum Gymnema inodorum (Lour.) Decne.
G. latifolium Gymnema latifolium Wall. ex Wight
G. reticulatum Gymnema reticulatum (Moon) Alst.
G. sylvestre Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult
G. yunnanense Gymnema yunnanense Tsiang
GYM Chất chuẩn gymnemagenin
Rf Ratio frequency - Hệ số di chuyển
SKĐ Sắc ký đồ
STT Số thứ tự
TLC Thin-layer chromatography – Sắc ký lớp mỏng
TT Thuốc thử
UPGMA Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical Averages
VIS Visible – Ánh sáng thường
UV Ultra violet – Ánh sáng tử ngoại
UV 366-TT
Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại 366nm sau khi phun thuốc
thử
VIS-TT Quan sát dưới ánh sáng trắng sau khi phun thuốc thử

7. DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Một số tác dụng sinh học đã công bố của các loài thuộc chi Gymnema R.Br.
..................................................................................................................................3
Bảng 1.2. Khóa phân loại các loài của chi Gymnema ở Việt Nam [2]............................4
Bảng 1.3. Tổng hợp sự khác biệt về cấu trúc khung chất chính của các loài trong chi
Gymnema R.Br........................................................................................................13
Bảng 2.1. Danh mục và ký hiệu các mẫu trong nghiên cứu (i và ii)…………………….14
Bảng 3.1. Sự xuất hiện các vết trên sắc ký đồ dịch chiết toàn phần mẫu nghiên cứu nhóm
1 khi quan sát ở bản mỏng sau phun thuốc thử………………………………..26
Bảng 3.2. Tổng hợp Rf và màu sắc các vết trên sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân các
mẫu thuộc loài G. sylvestre quan sát ở VIS-TT hoặc UV 366-TT.........................28
Bảng 3.3. Tổng hợp Rf và màu sắc các vết trên sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân các
mẫu thuộc loài G. latifolium quan sát ở VIS-TT hoặc UV 366-TT .......................29
Bảng 3.4. Tổng hợp Rf và màu sắc các vết trên sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân các
mẫu thuộc loài G. yunnanense và G. inodorum quan sát ở VIS-TT hoặc UV 366-TT
................................................................................................................................31
Bảng 3.5. Bảng hệ số tương đồng cặp đôi giữa các mẫu nghiên cứu, sử dụng chỉ số
Nei&Li....................................................................................................................33

8. DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Khung cấu trúc phần aglycon của các acid gymnemic phân lập được từ
Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult [52].....................................................5
Hình 1.2. Khung cấu trúc phần aglycon của các acid dạng C-4 gem-dimethylat olean
phân lập được từ Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult nguồn gốc Việt Nam
[37]............................................................................................................................6
Hình 1.3. Khung cấu trúc phần aglycon của các 3β-hydroxy oleaan triterpenoid phân lập
được từ Gymnema latifolium Wall. Ex Wight [38] ..................................................7
Hình 1.4. Khung cấu trúc của một số chất phân lập được từ loài Gymnema inodorum
(Lour.) Decne [44]. ...................................................................................................8
Hình 1.5. Khung cấu trúc chung của các aglycon C21 phân lập được từ Gymnema
yunnanense Tsiang [28], [62]. ..................................................................................9
Hình 2.1. Quy trình chiết - thủy phân các mẫu nghiên cứu………………………….…18
Hình 3.1. Sắc ký đồ khai triển dịch chiết toàn phần của các mẫu Gymnema nhóm
1………………………………………………………………………………..24
Hình 3.2. Kết quả chồng phổ sắc ký dịch chiết toàn phần tại VIS-TT các mẫu thuộc
nhóm 1 ....................................................................................................................25
Hình 3.3. Sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân của các mẫu Gymnema nhóm 1 ............30
Hình 3.4. Cây phân loại dựa trên phân tích UPGMA hệ số tương đồng giữa sắc ký đồ
của các mẫu.............................................................................................................33
Hình 3.5. Kết quả chồng phổ sắc ký đồ các mẫu GX2, GX3 và sắc ký đồ GS1...........34
Hình 3.6. Kết quả chồng phổ sắc ký đồ mẫu GX4 và sắc ký đồ GI..............................35
Hình 3.7. Kết quả chồng phổ sắc ký đồ mẫu GX1 và sắc ký đồ GS1, GL1 .................36

9. 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong nền y học cổ truyền Ấn Độ Ayurveda, Dây thìa canh (Gymnema sylvestre
(Retz) R. Br. Ex Schult) đã được sử dụng từ hơn 2000 năm nay để điều trị đái tháo
đường [56], [61]. Dựa trên kinh nghiệm này, hàng loạt các nghiên cứu đã được tiến hành
để chứng minh cơ chế tác dụng hạ đường huyết của cây và xác định các acid gymnemic
là nhóm hoạt chất chính liên quan đến tác dụng này [49], [53]. Dựa trên nguyên lý là
các loài cùng bậc taxon thực vật thường có các thành phần hóa học tương tự nhau do đó
có xu hướng có tác dụng sinh học giống nhau [3], một số nghiên cứu trên thế giới đã
chứng minh được tác dụng hạ đường huyết tương tự trên các loài cùng chi như:
Gymnema montanum Hook.f., Gymnema inodorum (Lour.) Decne, Gymnema
yunnanense Tsiang,…[18], [40], [46], [47], [58].
Tại Việt Nam, các nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết mới được thực hiện
trên chủ yếu 2 loài là Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult và Gymnema latifolium
Wall. Ex Wight [12], [16]. Bên cạnh một số sản phẩm thực phẩm chức năng như
Diabetna (Nam Dược), DK-betics (DK-Pharma),…còn rất nhiều trà thảo dược – dược
liệu khô của dây thìa canh được bán rộng rãi cùng một số sản phẩm có tên gọi “Dây thìa
canh” được sử dụng nhưng không thuộc hai loài đã nghiên cứu.
Vì vậy, việc nghiên cứu sự đa dạng vân tay sắc ký TLC của một số loài thuộc chi
Dây thìa canh giúp bước đầu phân biệt nhanh về hóa học, làm cơ sở cho việc kiểm
nghiệm và sử dụng đúng các loài trong chi Gymnema R.Br.; đề tài “Nghiên cứu xây
dựng vân tay sắc ký lớp mỏng của một số loài thuộc chi dây thìa canh - Gymnema
R.Br” được thực hiện với các mục tiêu sau:
- Xây dựng dấu vân tay sắc ký của một số loài thuộc chi Gymnema R.Br. bằng
phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao từ đó xây dựng cây phân loại dựa trên
thành phần hóa học (sắc ký đồ) của các mẫu nghiên cứu.
- Ứng dụng kết quả nghiên cứu phân tích sắc ký đồ của một số mẫu Dây thìa canh
thu được trên thị trường.

10. 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Chi Gymnema R. Br.
1.1.1. Vị trí phân loại thực vật chi Gymnema R.Br.
Theo hệ thống phân loại của Armen Takhtajan trong “Flowering Plants” (2009),
chi Gymnema R.Br. được sắp xếp theo thứ tự phân loại như sau:
Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp: Hoa môi (Lamiidae)
Bộ: Long đởm (Gentianales)
Họ: Trúc đào (Apocynaceae)
Phân họ: Thiên lý (Asclepiadoideae)
Chi: Gymnema R.Br [20].
1.1.2. Đặc điểm thực vật, phân bố và các loài trong chi trên thế giới
Các loài thuộc chi Gymnema R.Br. là cây leo, không có rễ phụ trên thân. Lá mọc
đối, không nạc. Cụm hoa xim, dạng tán hoặc chùm. Hoa nhỏ. Thùy đài nhỏ, hình trứng,
đầu tù, gốc đài có tuyến, ít khi không có tuyến. Tràng hình bánh xe, thùy tràng không
gập trong nụ, tiền khai vặn phải. Tràng phụ đơn, vảy tràng phụ dính ở tràng,
thường có các hàng lông xếp dọc theo tràng. Chỉ nhị dính nhau, bao phấn 2 ô, có phần
phụ ở đỉnh, hạt phấn dính thành khối phấn và có sáp bao bên ngoài vách khối phấn,
khối phấn không có mỏm ở đỉnh, cơ quan truyền phấn có gót đính và 2 chuôi, khối phấn
hướng lên, chỉ có một khối phấn trong mỗi ô phấn. Đầu nhụy phình lên hình trứng, đỉnh
bầu không thót lại thành dạng vòi nhụy. Cột nhị - nhụy hình ống nhọn đầu [21], [23].
Phân bố của chi Gymnema R.Br. khá rộng, ở vùng Tây châu Phi đến
Australia, châu Á [7]. Trong thực vật chí Trung Quốc, Tsiang và cộng sự đã mô tả và
xây dựng khóa phân loại chi Gymnema R.Br [21]. Năm 2011,
Jingyun Fang và cộng sự đã công bố bản đồ phân bố của 7 các loài Gymnema
R.Br. tại Trung Quốc [29]. Các tài liệu thực vật, Thái Lan ghi nhận có 3 loài, Ấn Độ có
2 loài, Indonesia 2 loài và Lào [27], Đài Loan có 1 loài [32].
Theo dự án “The plant list” thực hiện bởi Royal Botanic Gardens, Kew và Missouri
Botanical Garden khởi động từ năm 2010 đã xác định được 120 loài thuộc chi Gymnema
R.Br. thu thập từ các cơ sở dữ liệu khác nhau trên thế giới trong đó có 52 tên khoa học
được chấp nhận (43,3%), 50 tên được xác định là tên đồng nghĩa (41,67 %), và 18 tên

11. 3
chưa xác định được chính xác thông tin (15,0 %) [64]. Danh sách 52 loài thuộc chi
Gymnema R.Br. đã được chấp nhận theo “The plant list” [64] được trình bày trong phụ
lục 2.
1.1.3. Tác dụng sinh học của một số loài thuộc thuộc chi Gymnema R.Br.
Nhiều loài thuộc chi Gymnema R.Br. đã được nghiên cứu về hoạt tính sinh học
bao gồm tác dụng của dịch chiết toàn phần, của cao phân đoạn và của các hoạt chất được
phân lập từ cây. Tác dụng sinh học nổi bật của các loài thuộc chi Gymnema R.Br. gồm
hạ đường huyết, chống béo phì, chống oxy hóa và bảo vệ gan. Các thống kê và tài liệu
đi kèm thể hiện trong bảng 1.1.
Bảng 1.1. Một số tác dụng sinh học đã công bố của các loài thuộc chi Gymnema
R.Br.
Loài Tác dụng sinh học Tài liệu tham khảo
Gymnema sylvestre (Retz) R. Br.
Ex Schult
Hạ đường huyết [19], [43], [51], [14]
Hạ lipid máu và chống
béo phì
[19]
Bảo vệ gan [55]
Khả năng gây độc tế bào
khối u
[22], [55], [59], [39]
Hoạt tính kháng khuẩn [55]
Gymnema latifolium Wall. Ex
Wight
Hạ đường huyết [10], [14]
Gymnema inodorum (Lour.)
Decne
Hạ đường huyết [14]
Bảo vệ gan [54]
Gymnema yunnanense Tsiang Hạ đường huyết [14]
1.2. Chi Gymnema R.Br. ở Việt Nam
Theo các tác giả Phạm Hoàng Hộ (2000) [7], Võ Văn Chi (2004) [4], Trần Thế
Bách (2007) [2], chi Gymnema R.Br. phân bố ở Việt Nam có 6 loài là Gymnema
albiflorum Cost., Gymnema inodorum (Lour.) Decne, Gymnema latifolium Wall. Ex
Wight, Gymnema yunnanense Tsiang, Gymnema reticulatum (Moon) Alst. và Gymnema
sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult. Để xác định các loài này, TS. Trần Thế Bách (2007)
đã xây dựng khóa phân loại cho chi Gymnema R.Br. ở Việt Nam (bảng 1.2) sử dụng các

12. 4
đặc điểm phân loại chính của quả và hạt, bao gồm: kích thước quả, kích thước mào lông
và độ dài hạt [2].
Bảng 1.2. Khóa phân loại các loài của chi Gymnema ở Việt Nam [2]
1A. Quả dài hơn 12 cm…………………………………………………1.G. inodorum
1.B. Quả ngắn hơn 10 cm
2.A. Mào lông ngắn hơn 2,6 cm……………………………….……..2.G. yunnanense
2.B. Mào lông dài hơn hay bằng 3 cm
3.A. Chiều dài hạt ngắn hơn 0,9 cm…………………..…..…………....3.G. sylvestre
3.B. Chiều dài hạt lớn hơn 1 cm
4.A. Chiều dài quả ngắn hơn 6 cm; mào lông ngắn hơn 3,5 mm………...4.G. latifolium
4.B. Chiều dài quả dài hơn 6 cm; mào lông dài hơn 3,5 mm………......5.G. reticulatum
Các đặc điểm thực vật của 4 loài Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult,
Gymnema latifolium Wall. Ex Wight, Gymnema inodorum (Lour.) Decne và Gymnema
yunnanense Tsiang cũng đã được mô tả chi tiết trong nghiên cứu của tác giả Phạm Hà
Thanh Tùng năm 2012 [15].
1.2.1. Loài Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult
1.2.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố
Thân leo tới 8m, có lỗ vỏ rải rác, toàn thân có nhựa mủ trắng. Thân non có lông
sau nhẵn, thân bánh tẻ ở gần gốc có vân dạng cánh. Cuống lá 3-12 mm; phiến lá hơi dày
có trứng, bầu dục hoặc trứng ngược, kích thước 3-8.5 × 1.5-5.5 cm, có lông tơ hướng
trục trừ những đường khía dọc ở gân giữa, chuyển từ có lông mịn đến nhẵn ở gân chính.
Gân bên 4-5 cặp, uốn cong về phía mép lá. Cụm hoa xim ở nách lá thường ngắn hơn rất
nhiều so với lá, có nhiều lông. Trục cụm hoa 2-5mm, cuống hoa rụng để lại những vết
sẹo xoắn ốc xếp sát nhau. Đài 5, rời, hình trứng, có lông tơ. Tràng 5 hàn liền hình chuông,
màu trắng, vàng kem hoặc đỏ. Thùy tràng hình trứng, nhẵn, thường có vành màu trắng
ở mép thùy tràng. Tràng phụ 5, dài nhô ra ngoài đính ở họng tràng ở gốc có 2 dãy lông
màu nâu. Đầu nhụy hình nón trắng nhô ra ngoài. Bầu 2 lá noãn rời, hình trứng, dài 1 x
0,3 mm [15].
Quả 2 đại thường bị rụng chỉ còn 1, có dạng hình mác rộng, 5-9 × 2 cm, nhẵn,

13. 5
đáy tròn, đầu nhọn . Hạt hình trứng, mép dạng màng, 8 × 4 mm; mào lông màu trắng
mượt, dài khoảng 3.5 cm [15].
Tên thường gọi: Dây thìa canh, dây muôi, lõa ti rừng. Cây thường mọc hoang dại
ở bờ bụi, hang rào nhiều tỉnh như Hải Dương, Hưng Yên, Bắc Giang, Quảng Bình,
Quảng Trị,…[4], [15].
1.2.1.2. Thành phần hóa học
Các nghiên cứu sâu về thành phần hoá học của chi Gymnema R.Br chủ yếu được
tập trung vào loài Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult với các nhóm chất
triterpen saponin thuộc 2 nhóm olean và dammaran. Saponin khung olean có các acid
gymnemic và các gymnemasaponin [60], [63], trong khi đó các saponin khung
dammarane là các gymnemasid [25]. Trong lá Dây thìa canh lá nhỏ còn có resine,
albumin, chlorophyll, carbonhydrat, acid tartric, acid formic, acid butyric, anthraquinon,
alkaloid inositol, acid hữu cơ (5,5%), paraben, calci oxalat (7,3%), lignin (4,8%) và
cellulose (22%) [48], [49], [50].
Thành phần có tác dụng hạ đường huyết được xác định là các acid gymnemic, là
tên chung của các acid hữu cơ thuộc nhóm saponin triterpenoid [24], [33], [34], [49].
Các acid gymnemic là các dẫn chất thế acyl (Tiglolyl, Methyltutylrol,…) của acid
deacylgymnemic tương ứng là dẫn xuất thế 3-O-beta-glucoronid của gymnemagenin
[42]. Cấu trúc chung phần aglycon của gymnemagenin và 17 loại acid gymnemic được
minh họa trong hình 1.1 và phụ lục 6.
Hình 1.1. Khung cấu trúc phần aglycon của các acid gymnemic phân lập được từ
Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult [52]
Tuy nhiên, trong một nghiên cứu mới công bố vào năm 2018 của Phạm Hà Thanh
Tùng và cộng sự cho thấy loài G. sylvestre thu tại hai khu vực địa lý khác nhau là Ấn
R
1
O
R
5
R
6
OR
2
R
4

14. 6
Độ và Việt Nam có sự khác biệt về thành phần hóa học chính [37]. Thành phần hóa học
trong Dây thìa canh lá nhỏ Việt Nam gồm các acid dạng C-4 gem-dimethylat olean bao
gồm myrtillogen, chichipegenin, sitakisogenin, maniladiol, gymnemagenol, và 3b, 16b,
28-trihydroxyolean-12-en-29,22b-olid (hình 1.2). Kết quả này tương tự với một số
nghiên cứu về Dây thìa canh lá nhỏ tại Trung Quốc và khác biệt với các công bố đã có
về cây Dây thìa canh lá nhỏ có nguồn gốc Ấn Độ [37].
R
4
R
2
OH
H
R1
R
5
R
3
H
Hình 1.2. Khung cấu trúc phần aglycon của các acid dạng C-4 gem-dimethylat
olenan phân lập được từ Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult nguồn gốc
Việt Nam [37]
1.2.2. Loài Gymnema latifolium Wall. Ex Wight
1.2.2.1. Đặc điểm thực vật và phân bố
Thân leo tới 6m. Thân có lỗ vỏ, các nhánh có nhiều lông tơ. Cuống lá 1,5 - 4 cm,
có lông tơ dày đặc; phiến lá 8-13 × 5-8 cm, lông dày đặc, càng xa trục càng dày đặc, gốc
tròn, ngọn nhọn, gân bên 6-7 cặp. Cụm hoa xim dạng đầu thành từng đôi ở mấu, có lông
dày. Một cụm mang rất nhiều hoa, mùi thơm. Cuống cụm hoa 1-1,5 cm, cuống hoa 3-8
mm. Đài hình trứng, phủ lông măng. Tràng hoa vàng, hình chuông, nhẵn ở mặt ngoài.
Ống hoa có 5 cặp gờ mang lông ở họng tràng, các thùy hình trứng, khoảng 1,2 ×
1,2 mm, phủ lông dày đặc hướng trục, ngắn hơn so với ống tràng. Khối nhị nhụy dạng
hình trụ, phần phụ nhị dạng màng ngắn hơn so với đầu núm nhụy. Khối phấn hình thuôn.
Đầu núm nhụy hình nón, đỉnh phân đôi [15].
Quả đại hình mác nhọn, 4,5-5,5 × 1,5-2 cm. Hạt hình trứng thuôn, dài khoảng
1,1 cm × 5 mm, mép dạng màng; mào lông dài 3 cm [15].
Tên thường gọi: Dây thìa canh lá to, lõa ti lá rộng. Loài Gymnema latifolium
Wall. Ex Wight được phân bố ở đảo Andaman và Nicobar, Bangladesh, Trung Quốc

15. 7
(Quảng Đông, Quảng Tây, Vân Nam), Ấn Độ (Arunachal Pradesh, Assam, Kerala,
Maharashtra, Tamil Nadu), Myanmar, Thailand [57], Việt Nam (Gia Lai, Tây Ninh,
Tuyên Quang, Hoà Bình, Thái Nguyên) [15].
1.2.2.2. Thành phần hóa học
Tại Việt Nam, bằng các phản ứng hóa học định tính xác định được trong lá cây
G. latifolium có mặt của các nhóm chất chính như: saponin, flavonoid, coumarin, tanin,
chất béo, đường khử, acid amin và acid hữu cơ. Trong đó, saponin và flavonoid là 2
nhóm chất chính của dược liệu [5], [11]. Hàm lượng saponin trung bình trong dược liệu
là: 5,60% ± 0,11 [11].
Dịch chiết G. latifolium sau khi thuỷ phân bằng acid và kiềm cho thấy có pic
tương ứng với pic của chất chuẩn gymnemagenin trên sắc ký đồ sau khi triển khai bằng
kỹ thuật HPTLC [15]. Điều này phù hợp với nghiên cứu của tác giả Trần Thị Oanh năm
2014 với 2 acid gymnemic đã phân lập được là acid gymnemic I và acid gymnemic IV
(2 chất có cùng khung cấu tạo như khung hình 1.1) [11].
Bên cạnh đó, các nhóm hợp chất khác đã được chiết xuất, phân lập và xác định
cấu trúc trong Dây thìa canh lá to bao gồm 3 hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat là:
stigmasterol, lupeol acetat và 3β-acetoxy – 22,23,24,25,26,27 – hexanordammaran – 20
– one [10]. Gần đây nhất, năm 2020, Phạm Hà Thanh Tùng và cộng sự đã phân lập được
các 3β-hydroxy olean triterpenoid với khung aglycon là gynemagenin và
longispinogenin [38] (chi tiết trong phụ lục 6).
R
4
R
6
H
R1
H
R3
R
2
R
5
Hình 1.3. Khung cấu trúc phần aglycon của các 3β-hydroxy olean triterpenoid
phân lập được từ Gymnema latifolium Wall. Ex Wight [38]

16. 8
1.2.3. Loài Gymnema inodorum (Lour.) Decne
1.2.3.1. Đặc điểm thực vật và phân bố
Dây leo tới 10m. Thân nhẵn, các nhánh non có màu nâu nhạt, có lỗ vỏ, phủ lông
măng. Cuống lá 2-6 cm; bề mặt lá nhẵn, hình trứng thuôn hoặc hình trứng rộng, 4-13 ×
2-9 cm, nhẵn hoặc phủ lông măng ở dọc gân lá. Gốc lá tròn hoặc hình tim nông, ngọn
lá nhọn hoặc nhọn kéo dài, 4-6 cặp gân bên. Cụm hoa xim dạng chùm xếp giống như
đầu, xếp xoắn ốc, tới 4 cm; Cuống cụm hoa 1-2 cm. Cuống hoa 1-1.5 cm. Đài thuôn, 2-
3 × 1.4 mm, ngắn hơn ống tràng, có lông măng hoặc lông mịn. Tràng hoa màu vàng, 6-
7 mm, có lông mịn dày đặc phía ngoài. Ống tràng dạng hình trụ, nhẵn trừ các dãy lông
dọc theo phần kẽ ống tràng, xen kẽ với các thùy tràng; Thùy tràng hình chữ nhật, 3-4 ×
1.6-1.8 mm, chóp nhọn, nhẵn trừ mép có lông tơ. Khối phấn hình chữ nhật. Đầu núm
nhụy có hình mái vòm, thò lên trên ống tràng [15].
Quả hai đại, hình mác, dài 16x3 cm, vỏ quả dày và hơi có sợi. Vỏ quả nhẵn. Hạt
khoảng 1.5x1 cm; mào lông khoảng 4 cm [15].
Tên thường gọi: Lõa ti không mùi, Lõa ti nhuộm, Rau mỏ, Dây thìa canh lá to.
Phân bố ở Nam Bộ, Nha Trang, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Hòa Bình, Vĩnh Phúc,...mọc
rộng khắp trên đất rừng, cạnh suối và lùm bụi [15].
1.2.3.2. Thành phần hóa học
Năm 2001, từ lá của G. inodorum, tác giả Kazumasa Shimizu đã phân lập được
4 hợp chất thuộc nhóm olean triterpenoid với một nhóm thế methyl anthranilat đặc trưng
gồm GiA-1, GiA-2, GiA-5 và GiA-7 [44]. Công thức khung chung của các chất này
minh họa trong hình 1.4 và phụ lục 6.
CH2R
4
R3
OH
O
CH2R
1
O
HOOC
OH
OR
6
OR
5
R
2
Hình 1.4. Khung cấu trúc của một số chất phân lập được từ loài Gymnema
inodorum (Lour.) Decne [44].

17. 9
1.2.4. Loài Gymnema yunnanense Tsiang
1.2.4.1. Đặc điểm thực vật và phân bố
Thân bụi leo, cao tới 8m. Thân bánh tẻ phình lên thành các rãnh sâu, thân non có
nhiều lỗ vỏ, bề mặt phủ lông dày đặc màu vàng sét. Toàn thân có nhựa mủ vàng. Lá đối,
cuống lá 0,8-1,5 cm. Phiến lá hình trứng, bầu dục hoặc trứng ngược, kích thước lá 6-13
× 2,5-6 cm, 5-6 cặp gân lông chim. Toàn bộ bề mặt phiến lá và gân lá có phủ lông sét
nâu. Mép lá nguyên, gốc lá tù hoặc tròn, ngọn lá nhọn. Cụm hoa xim mọc đối xứng nách
lá, mỗi cụm 12-20 hoa. Cuống 3- 4mm. Lá đài 5,2x2 mm rời, hình trứng, có lông dày
đặc. Tràng hàn liền màu vàng, mép thùy tràng có vành màu vàng kem nhạt. Ống thùy
hình trứng, 4x4mm, có phần phụ ở họng tràng mang lông dày màu vàng nâu. Phần phụ
của nhị rộng, thò cao lên trên ống tràng nhưng vẫn thấp hơn đầu núm nhụy. Khối phấn
hình khối chữ nhật, thẳng đứng, Đầu núm nhụy hình cầu, thò ra ngoài. Bộ nhụy gồm 2
lá noãn rời nhau. Hạt hình trứng thuôn dài 1,3-1,5 cm x 6 mm, mép dạng màng, mào
lông dài 2,5 cm [15].
Tên thường gọi: Lõa ti Nam Vân hay Dây thìa canh Vân Nam. Phân bố ở Kiên
Giang, Kom Tum, Gia Lai và Đắc Lắc [2], [4], [7].
1.2.3.2. Thành phần hóa học
Theo các tài liệu tham khảo, từ dịch chiết sau thủy phân của Dây thìa canh Vân
Nam đã xác định được các saponin có 4 khung aglycon C21 steroidal là penupogenin,
20- O-cinnamoylsarcostin, sarcostin và metaplexigenin. Bên cạnh đó, một loại aglycon
mới được phát hiện gymnemarsgenin [28].
Năm 1991, từ dịch chiết toàn phần của lá Gymnema yunnanense Tsiang, Zhang
và cộng sự đã phân lập được hai glycosid C21 mới có tên là gymnemarosid A và B [62].
Các khung này (hình 1.5 và phụ lục 6) có cấu trúc khác biệt so với các loài Dây thìa
canh khác (hình 1.3).
OH
OR1 OR2
OH
OR
R3O
Hình 1.5. Khung cấu trúc chung của các aglycon C21 phân lập được từ Gymnema
yunnanense Tsiang [28], [62].

18. 10
1.3. Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao
1.3.1. Sắc ký lớp mỏng
Quá trình tách hỗn hợp các chất bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) xảy ra khi cho pha
động chuyển qua pha tĩnh. Trong TLC pha tĩnh được rải thành lớp mỏng trên giá đỡ
phẳng. Dưới tác động của lực mao quản, pha động thấm theo lớp mỏng đi qua điểm xuất
phát – nơi mẫu được đưa lên bản mỏng. Trong quá trình di chuyển của pha động qua
pha tĩnh, nhờ quá trình hấp phụ và giải hấp phụ được lặp lại nhiều lần và hệ số phân bố
khác nhau mà những chất khác nhau sẽ di chuyển theo hướng của pha động với tốc độ
khác nhau. Kết quả mỗi chất phân tích sẽ được tách riêng ra ở các vị trí khác nhau trên
bản mỏng [13].
1.3.2. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao
HPTLC là dạng nâng cao và tự động hóa của TLC và cho phép phun mẫu lên bản
mỏng chính xác hơn và đánh giá định lượng các vết được tách. Sự cải tiến về kỹ thuật
này làm tăng hiệu lực tách và giảm thời gian phân tích. Sự khác nhau giữa TLC và
HPTLC ở chỗ kích thước và mức độ đồng đều hạt của chất hấp phụ. TLC thường có
phạm vi kích thước hạt từ 10-15µm, trung bình khoảng 20µm nhưng với HPTLC phạm
vi kích thước hạt nhỏ hơn và kích thước hạt trung bình khoảng 5µm. Phương pháp đưa
mẫu lên bản mỏng cũng được cải tiến với thiết kế dụng cụ phun mẫu chính xác làm giảm
đường kính vết phun ban đầu. Những cải tiến này làm giảm đáng kể thời gian và tăng
hiệu lực tách của peak [1], [31].
HPTLC là một kỹ thuật đơn giản, trực quan và thực dụng, có khả năng mang lại
kết quả đáng tin cậy và có thể tái tạo, dựa trên phương pháp được tiêu chuẩn hóa và sử
dụng SST cho chất lượng tấm. Những cải tiến được giới thiệu trong Dược điển, đặc biệt
là trong Dược điển Châu Âu và Dược điển Mỹ, cùng với thiết bị và phần mềm cho phép
ghi lại hình ảnh điện tử chuẩn hóa của sắc ký đồ (dấu vân tay) và sự biến đổi của chúng
thành cấu hình đỉnh (PPI), mở ra cánh cửa để lấy thông tin định lượng từ phân tích được
thực hiện để nhận dạng. Dựa vào đó, khái niệm về dấu vân tay HPTLC toàn diện đã
được giới thiệu. Nó cho phép đơn giản hóa các quy trình kiểm soát chất lượng đối với
thuốc/ chế phẩm/ sản phẩm thảo dược, bởi vì từ một phân tích HPTLC duy nhất, có thể
thu được thông tin về nhận dạng, độ tinh khiết và đặc tính [41].

19. 11
1.4. Vân tay sắc ký thực vật
Khái niệm dấu vân tay hóa học được đề cập trong phụ lục 12.23 Dược điển Việt
Nam V như sau: dấu vân tay hóa học là các thông tin hóa học của dược liệu được biểu
thị dưới dạng sắc ký đồ, các phổ và các đồ thị… được ghi bằng các kỹ thuật phân tích
(kỹ thuật sắc ký) hay còn được gọi là sắc ký đồ dấu vân tay [8].
Nói cách khác sắc ký đồ dấu vân tay là một hồ sơ sắc ký bao gồm tất cả các vết
sắc ký của các thành phần đặc trưng từ dược liệu hoặc thuốc từ dược liệu được nghiên
cứu. Hồ sơ sắc ký sẽ cung cấp thông tin như tính toàn vẹn, độ đậm nhạt, sự giống hay
khác nhau của các chất đặc trưng cho loài. Do đó, với dấu vân tay sắc ký thu được có
khả năng xác thực cũng như xác định các loài dược liệu một cách hiệu quả ngay cả khi
số lượng và/hoặc nồng độ các thành phần đặc trưng hóa học là không giống nhau giữa
các mẫu khác nhau [30].
Như vậy, dấu vân tay có khả năng cung cấp thông tin cho ba cấp độ kiểm soát
chất lượng phân tích. Những mức độ kiểm soát chất lượng là:
- Xác định thực vật (xác thực loài, tuổi và nguồn gốc);
- Định lượng hoạt chất;
- Phát hiện tạp chất, chất gây ô nhiễm hoặc chất pha trộn [17].
Theo hướng dẫn của WHO về việc lựa chọn các chất đánh dấu của dược liệu để
kiểm soát chất lượng thuốc thảo dược [35], tiêu chí lựa chọn các chất tham chiếu và
kiểm soát chất lượng thuốc thảo dược nên tính đến các thành phần khác nhau có thể có
mức độ ảnh hưởng khác nhau đến chất lượng, an toàn và hiệu quả cuối cùng. Do đó, thứ
tự lựa chọn các chất để xác định và định lượng phải tuân theo các quy tắc được trình bày
dưới đây:
- Nếu các thành phần có tác dụng đã biết và đã được xác định, chúng nên được sử
dụng làm vết đánh dấu.
- Nếu không phải là trường hợp 1 nhưng thành phần được công nhận tác dụng dược
lý nên được sử dụng làm vết đánh dấu.
- Nếu các trường hợp trên không được áp dụng, danh tính của nguyên liệu thảo
dược, chế phẩm và thuốc có thể được xây dựng bằng cách phân tích (các) chất
đánh dấu là các thành phần đặc trưng khác.
- Ngoài ra cũng có thể dùng dược liệu chuẩn để đối chiếu.
Tổ chức Y tế Thế giới WHO cũng đã đưa ra định nghĩa về chất đặc trưng như

20. 12
sau: “Một thành phần chất tự nhiên có trong một bộ phận của cây có thể được dùng để
đảm bảo cho sự nhận biết hoặc đảm bảo chất lượng chế phẩm của cây thuốc đó, không
nhất thiết là hoạt chất” [35].
Các phương pháp sắc ký xác định dấu vân tay đang được sử dụng là TLC,
HPTLC, HPLC, GC, hoặc sắc ký kết hợp đo phổ LC-MS, GC-MS, HPLC-DAD…[30].
Phương pháp sắc ký lớp mỏng và sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao có nhiều ưu điểm so
với các phương pháp khác là:
- Có thể phân tích đồng thời nhiều mẫu, tiết kiệm chi phí, dung môi và thời gian
- Có thể vừa định tính vừa định lượng
- Các mẫu phân tích và các mẫu chuẩn được phun trên cùng một bản mỏng sắc ký,
khai triển cùng lúc trong cùng điều kiện dung môi, nhiệt độ, độ ẩm nên có thể so
sánh trực tiếp đối chứng nhau, hạn chế sự tác động của môi trường giữa các lần
phân tích.
- Chuẩn bị mẫu đơn giản, không cần xử lý dung môi trước (lọc hay siêu âm).
* * * * * *
Như vậy, theo các tài liệu ghi nhận được, có 04 loài thuộc chi Gymnema R.Br. là
G. sylvestre, G. latifolium, G. inodorum và G. yunnanense ở Việt Nam hiện đang được
nghiên cứu đều có tác dụng hạ đường huyết ở các mức độ khác nhau. Bên cạnh những
đặc điểm tương đối khác biệt về hình thái, các aglycon trong khung cấu trúc saponin của
thành phần hóa học bốn loài Dây thìa canh này cũng có sự khác biệt nhất định (bảng
1.3). Chính sự khác biệt về cấu trúc sẽ dẫn đến sự khác biệt về các vết sắc ký trên sắc
ký đồ của từng loài Dây thìa canh.
Mặt khác, trên thị trường, khi các chế phẩm đã sử dụng dạng dược liệu khô cắt
nhỏ hoặc dạng cao chiết từ Dây thìa canh nên rất khó có thể nhận biết được sự có mặt
của loài Dây thìa canh nào trong chế phẩm nhờ cảm quan. Do đó, nghiên cứu dự kiến
sử dụng các vết sắc ký điển hình là cơ sở quan trọng để có thể bước đầu phân biệt được
các loài trong chi dựa trên bằng chứng hóa học đơn giản.

21. 13
Bảng 1.3. Tổng hợp sự khác biệt về cấu trúc khung chất chính của các loài trong
chi Gymnema R.Br.
Khung saponin chính trong loài G.
sylvestre nguồn gốc Ấn Độ
R
4
R
2
OH
H
R1
R
5
R
3
H
Khung saponin chính trong loài G.
sylvestre nguồn gốc Việt Nam
R
4
R
6
H
R1
H
R3
R
2
R
5
Khung saponin chính trong loài G.
latifolium
OH
OR1 OR2
OH
OR
R3O
Khung saponin chính trong loài G.
yunnanense
CH2R
4
R3
OH
O
CH2R
1
O
HOOC
OH
OR
6
OR
5
R
2
Khung saponin chính trong loài G. inodorum
R
1
O
R
5
R
6
OR
2
R
4

22. 14
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Mẫu nghiên cứu
- Mẫu nghiên cứu xây dựng vân tay sắc ký theo loài (nhóm 1): Các mẫu thuộc
chi Gymnema R.Br. thu hái ở Hòa Bình, Quảng Bình, Nam Định và vùng trồng Dây thìa
canh ở Phú Lương, Thái Nguyên; được thu hái trong thời gian gần nhau vào tháng 5 và
đầu tháng 6 năm 2020. Các mẫu nghiên cứu đều được giám định tên khoa học và lưu
mẫu tại phòng tiêu bản của Trường Đại học Dược Hà Nội (phụ lục 1).
Tên loài, địa điểm, thời điểm thu mẫu, dạng mẫu lúc thu và ký hiệu trong nghiên
cứu của từng mẫu được thể hiện trong bảng 2.1-i.
- Mẫu nghiên cứu để so sánh sắc ký đồ và xác định loài (nhóm 2): Là các mẫu
thu mua trên thị trường, thông tin mẫu thể hiện trong bảng 2.1-ii.
Bảng 2.1. Danh mục và ký hiệu các mẫu trong nghiên cứu (i và ii)
i) Mẫu xây dựng vân tay sắc ký
STT Loài
Tên thường
gọi
Thời gian, địa điểm
thu mẫu
Dạng mẫu
lúc thu
Ký
hiệu
1
G. sylvestre
Dây thìa canh
lá nhỏ
16/5/2020, Yên Ninh,
Phú Lương, Thái
Nguyên
Lá tươi GS1a
2
T6/2020, Hải Hậu,
Nam Định
Dược liệu
khô lẫn cành
và lá
GS3
3 T6/2020, Quảng Bình GS4
4 T6/2020, Quảng Bình GS5
5
Dây thìa canh
nhập nội
16/5/2020, Yên Ninh,
Phú Lương, Thái
Nguyên
Lá tươi GS2
6
G. latifolium
(Dây thìa
canh lá to)
Thái Nguyên
16/5/2020, Yên Ninh,
Phú Lương, Thái
Nguyên
Lá tươi
GL1a
7 Giống gốc GL2a
8 Thái Lan GL3a
9 Cuống ngắn GL4a
10 Cuống dài GL5a

23. 15
STT Loài
Tên thường
gọi
Thời gian, địa điểm
thu mẫu
Dạng mẫu
lúc thu
Ký
hiệu
11
G.
yunnanense
Dây thìa canh
Vân Nam
16/5/2020, Yên Ninh,
Phú Lương, Thái
Nguyên
Lá tươi GYa
12 G. inodorum
T6/2020, Kim Bôi,
Hòa Bình
Lá tươi GIa
ii) Mẫu nghiên cứu để so sánh sắc ký đồ và xác định loài
STT Thời gian, địa điểm thu mẫu
Dạng mẫu lúc
thu mua
Ký hiệu
trong nghiên
cứu
13
T6/2020, sản phẩm Trà dây thìa canh đặc
biệt của công ty DK natura, Thái Nguyên
Dược liệu khô
gồm cành và lá
GX1
14 T6/2020, chợ thuốc Lãn Ông, Hà Nội GX2
15
T5/2020, sản phẩm từ công ty Dược liệu
Indochina Herb, Hà Nội
GX3
16
T6/2020, mua tại chợ ở Kim Bôi, Hòa
Bình
GX4
2.1.2. Trang thiết bị nghiên cứu
2.1.2.1. Hóa chất, dung môi
- Hóa chất, dung môi và thuốc thử được sử dụng đều đạt tiêu chuẩn phân tích
theo Dược điển Việt Nam V: KOH, toluen, aceton, methanol, ethanol 96%, ethylacetat,
acid formic, HCl đặc, H2SO4 đặc, nước cất, thuốc thử hiện màu vanillin-acid sulfuric
(pha theo phụ lục 2.1.1 Dược điển Việt Nam V tập 2: Trộn đồng lượng dung dịch vanilin
1% trong ethanol 96% và dung dịch acid sulfuric 5% trong ethanol 96%; pha trước khi
dùng [8]),…
- Chất chuẩn: Gymnemagenin (thông số mẫu: lot PRF9072601, cas 22467-07-8,
độ tinh khiết 99,4%), cân 5.32mg hòa tan trong vừa đủ 5.0ml MeOH, lắc đều, bảo quản
trong ngắn mát tủ lạnh. Nồng độ dung dịch chuẩn 1.064 mg/ml (pha sẵn do Viện kiểm
nghiệm thuốc trung ương cung cấp).
- Bản mỏng chạy TLC Silica Gel GF254 (Merck).

24. 16
2.1.2.2. Dụng cụ và thiết bị dùng trong thí nghiệm
- Các dụng cụ thí nghiệm thường quy (bình nón nút mài, giấy lọc, cốc có mỏ, bình
gạn, ống đong, ống ly tâm, pipet…) và các dụng cụ khác (mao quản, bình khai
triển sắc ký…)
- Máy cất quay chân không Büchi B-490 và R-220 (Thụy Sỹ)
- Cân kỹ thuật Sartorius, độ chính xác 0,01 g (Đức)
- Cân phân tích Shimadzu, độ chính xác 0,0001g (Nhật Bản)
- Tủ sấy Memmert (Đức)
- Bể siêu âm Ultrasonic LC60H (Đức)
- Máy li tâm lạnh Centrifuge (Trung Quốc)
- Hệ thống HPTLC CAMAG gồm: bàn tiêm mẫu tự động LIMONAT V, bình khai
triển bản mỏng tự động ADC2, buồng chụp sắc ký TLC Visualizer, máy nhúng
thuốc thử, máy vi tính với phần mềm điều khiển winCATS và phần mềm phân
tích VideoSan (Thụy Sỹ).
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Khảo sát một số thông số của quy trình phân tích vân tay sắc ký các mẫu nghiên
cứu
- Khảo sát điều kiện chạy sắc ký cho dịch chiết toàn phần và dịch chiết phân đoạn
ethyl acetat sau thủy phân gồm: hệ dung môi pha động, thể tích tiêm mẫu nhằm lựa chọn
được điều kiện ra được sắc ký đồ tách biệt rõ nét nhất khi hiện màu bằng UV 254nm,
UV 366nm và thuốc thử vanilin-acid sulfuric.
- Xây dựng quy trình tối ưu từ các yếu tố đã nghiên cứu cho phân tích HPTLC
bằng hệ thống CAMAG.
2.2.2. Xây dựng vân tay hóa học của một số loài thuộc chi Gymnema R.Br.
Tiến hành triển khai sắc ký lớp mỏng và phân tích sắc ký đồ dịch chiết trước và
sau thủy phân của các mẫu nghiên cứu từ đó xây dựng vân tay sắc ký điển hình của mỗi
loài.
2.2.3. Xây dựng cây phân loại dựa trên thành phần hoá học (sắc ký đồ) của các mẫu
nghiên cứu.
Tiến hành phân tích sự đa dạng về thành phần hóa học giữa các loài trong chi
Gymnema dựa trên các thông tin vân tay sắc ký thu được từ đó xây dựng cây phân loại
đến loài theo sự xuất hiện các vết trên sắc ký đồ ở các mẫu nghiên cứu.

25. 17
2.2.4. Ứng dụng phân tích sắc ký đồ của một số mẫu Dây thìa canh thu được trên thị
trường
Tiến hành sắc ký và so sánh sắc ký đồ của các mẫu Dây thìa canh trên thị trường
với sắc ký đồ của các mẫu nghiên cứu để có kết luận ban đầu về sự xuất hiện của các
loài Gymnema trong các mẫu Dây thìa canh thu được trên thị trường.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Chuẩn bị mẫu phân tích
Các mẫu nghiên cứu được chiết đồng thời bằng 2 phương pháp để thu được dịch
chiết toàn phần và dịch chiết sau khi thủy phân. Trong đó, mẫu GS1a được lựa chọn làm
mẫu khảo sát quy trình phân tích.
2.3.1.1. Chuẩn bị dược liệu
- Với các mẫu thu được lá tươi: Mẫu được rửa sạch, sấy khô ở 55o
C đến hàm ẩm
dưới 12%. Với các mẫu dược liệu khô: Chọn lấy phần lá làm nguyên liệu nghiên cứu.
- Các mẫu sau đó được xay đến bột thô và rây qua rây 0,71mm bảo quản trong
túi nilon kín.
2.3.1.2. Chuẩn bị dịch chiết toàn phần
Cân chính xác khoảng 2g bột dược liệu vào bình nón nút mài 250ml. Tiến hành
chiết siêu âm 3 lần, mỗi lần với 50ml ethanol 70% trong 30 phút. Lọc, gộp dịch, cô đến
cắn. Cắn này hòa tan trong 10ml methanol rồi đi ly tâm lấy dịch làm mẫu chấm sắc ký.
2.3.1.3. Chuẩn bị dịch chiết sau thủy phân
Dược liệu được thủy phân các liên kết glycosid trong môi trường acid rồi làm
lạnh để tủa xuống aglycon dạng muối; kiềm hóa tủa này thu được aglycon dạng base.
Chiết đồng lượng lỏng-lỏng bằng ethyl acetat (lắc trong bình gạn) dịch nước chứa
aglycon base này thu được phân đoạn các aglycon tan trong ethyl acetat, lấy tất cả các
chất trong phân đoạn này làm dịch phun sắc ký. Quy trình chi tiết thể hiện trong hình
2.1.

26. 18
Hình 2.1. Quy trình chiết - thủy phân các mẫu nghiên cứu

27. 19
2.3.2. Lựa chọn điều kiện triển khai sắc ký
- Bản mỏng: TLC silicagel 60 F254 (Merck) được hoạt hóa ở 105o
C trong vòng
30 phút, sau đó lấy ra để nguội để triển khai sắc ký.
- Kích thước bản mỏng: 10x10 cm hoặc 10x20 cm
- Đưa mẫu lên bản mỏng bằng máy tiêm mẫu Linomat V. Vị trí tiêm mẫu cách
mép dưới bản mỏng là 8,0 mm, khoảng cách giữa vết ngoài cùng và mép ngoài bản
mỏng là 15,0 mm. Độ rộng của vết là 8 mm.
- Khảo sát thể tích tiêm mẫu: tiêm những thể tích khác nhau (dịch chiết toàn phần
khảo sát các thể tích tiêm: 0,5µl; 1µl; 1,5µl, 2µl; dịch chiết sau thủy phân khảo sát ở các
thể tích: 6µl; 8µl; 10µl, 12µl của cùng dịch chiết mẫu GS1a trên cùng một bản mỏng
silicagel G60F254, khai triển với hệ dung môi được lựa chọn ở dưới. Lựa chọn thể tích
tiêm mẫu phù hợp cho vết đủ rõ, gọn.
- Hệ dung môi khai triển: Tiến hành khảo sát một mẫu dịch chiết GS1a với lần
lượt các hệ dung môi sau:
Hệ 1: Cloroform: methanol: nước (15:5:1)
Hệ 2: n-butanol: acid acetic: nước (4:1:5, lớp trên)
Hệ 3: Ethyl acetat: acid acetic: nước (8:2:1)
Hệ 4: Ethyl acetat: methanol: nước (100:17:13)
Hệ 5: Cloroform: methanol: acid formic (10:1,1:0,02)
Hệ 6: Ehtyl acetat: methanol: acid formic (5:4:0,02)
Hệ 7: Toluen: ethyl acetat: acid formic (5:4:1)
Hệ 8: n-hexan: ethyl acetat: acid formic (5:4:1)
- Điều kiện chạy sắc ký lớp mỏng
+ Điều kiện môi trường: nhiệt độ: 28o
C, độ ẩm: 70%.
+ Thể tích dung môi bão hòa: 25 ml; thể tích dung môi khai triển: 10,0 ml.
+ Thời gian bão hòa dung môi: 15 phút.
+ Thời gian sấy bản mỏng: 5 phút
+ Quãng đường di chuyển của dung môi pha động: 80,0 mm.
- Bản mỏng được hiện màu bằng cách:
+ Soi dưới đèn UV bước sóng 254 nm và 366 nm.
+ Hiện màu bằng dung dịch valinin-acid sulfuric (TT) (chuẩn bị như mục
2.1.2.1). Bản mỏng sau đó được sấy ở 105o
C trong 10 phút và quan sát

28. 20
dưới ánh sáng thường và dưới UV 366nm.
Dựa trên kết quả quan sát được, chọn pha động cho các vết sắc ký tách nhau, gọn,
ít bị kéo đuôi và có Rf của các chất nằm trong khoảng tối ưu từ 0,10 - 0,90 cho các
nghiên cứu tiếp theo.
2.3.3. Tiến hành phân tích vân tay sắc ký các dịch chiết một số loài trong chi
Gymnema R.Br. theo quy trình đề xuất
- Chuẩn bị các mẫu nghiên cứu theo mục 2.3.1 ở trên.
- Triển khai sắc ký các mẫu theo điều kiện ở mục 2.3.2 với thể tích phun tối ưu
và một hệ dung môi khai triển được chọn có hiệu lực tách tốt nhất.
- Chụp ảnh bản mỏng, xác định các vết chính trên sắc ký đồ, tính giá trị Rf và
màu sắc của từng vết tương ứng thu được.
- Xác định vết đặc trưng của chi và loài:
+ Vết đặc trưng của chi: Vết sắc ký xuất hiện ở tất cả các mẫu nghiên cứu
thuộc chi Gymnema R.Br. khi tiến hành phân tích trên cùng điều kiện triển
khai sắc ký.
+ Vết đặc trưng của loài: Vết sắc ký chỉ xuất hiện ở 1 loài nghiên cứu mà
không xuất hiện ở các loài khác khi tiến hành cùng điều kiện sắc ký.
2.4. Phương pháp xử lý kết quả
Để xây dựng vân tay sắc ký: Tiến hành phân tích số lượng, màu sắc, Rf của các
vết trên sắc ký đồ tương ứng của các mẫu trong cùng một loài. và giữa các loài với nhau
để tìm ra những vết sắc ký đặc trưng cho chi/loài/giống.
Để xây dựng cây phân loại dựa trên hình ảnh sắc ký đồ: Tiến hành thống kê đặc
điểm thành phần hóa học của các mẫu qua các kết quả sắc ký đồ thu được. Sự có mặt
của các “vết” trên sắc ký đồ được mã hóa nhị biến, trong đó “1” là có vết và “0” là không
có vết. Mặt khác, những vết có cùng Rf nhưng có màu sắc khác nhau thì được coi là 2
vết khác nhau khi khai biến. Hệ số đồng dạng Sij của các mẫu được tính theo công thức
của Nei&Li:
Sij =
2 Nij
𝑁𝑖+𝑁𝑗
Trong đó: Sij là hệ số đồng dạng
Nij là số vết chung của 2 loài i và j
Ni là số vết của loài i
Nj là số vết của loài j

29. 21
Trên cơ sở bảng hệ số đồng dạng vết trên sắc ký đồ của các mẫu nghiên cứu xây
dựng vân tay sắc ký, sử dụng phương pháp phân tích cụm (Cluster Analysis) để xây
dựng cây phân loại đặc điểm thành phần hóa học theo phương pháp khoảng cách liên
kết trung bình UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical Averages)
bằng phần mềm NTSYSpc 2.1.
(Nguyên tắc: Cluster Analysis là phương pháp sử dụng phương thức liên kết hoàn
chỉnh để phân cụm theo phân cấp mặc định. Phương pháp phân cụm này xác định khoảng
cách cụm giữa hai cụm là khoảng cách tối đa giữa các thành phần riêng lẻ của chúng.
Trong quá trình kết tụ phân cấp, mỗi quan sát bắt đầu như một nhóm riêng biệt. Hai cụm
gần nhất được hợp nhất thành một cụm mới. Quá trình được lặp lại cho đến khi toàn bộ
tập dữ liệu được kết tụ thành một cụm duy nhất. Đầu ra mang lại một cây phân loại cho
thấy mối quan hệ giữa các quan sát và giữa các cụm mà chúng được hợp nhất liên tiếp.
Cây phân loại về thành phần hoá học được xây dựng để xác định quan hệ gần gũi
giữa các mẫu nghiên cứu trong chi Gymnema R.Br. ở khu vực nghiên cứu).
Để so sánh và bước đầu nhận dạng các mẫu Dây thìa canh trên thị trường: Tiến
hành so sánh số lượng, màu sắc, Rf của các vết sắc ký trên sắc ký đồ tương ứng và tiến
hành chồng phổ với các mẫu nghiên cứu để so sánh sự tương đồng.

30. 22
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM
3.1. Kết quả khảo sát một số thông số của quy trình phân tích vân tay sắc ký các
mẫu nghiên cứu
Đối tượng khảo sát: Mẫu Dây thìa canh lá nhỏ có ký hiệu GS1a.
3.1.1. Với dịch chiết toàn phần
Sau khi khảo sát các hệ dung môi pha động (mục 2.3.2), pha động ổn định và có
hiệu lực tách tốt nhất đối với dịch chiết toàn phần của mẫu GS1a là hệ dung môi số 4
gồm ethyl acetat: methanol: nước tỷ lệ 100:17:13. Hệ dung môi này cho sắc ký đồ của
mẫu khảo sát GS1a có nhiều vết sắc ký ở các bước sóng UV 254 nm và UV 366 nm.
Sau khi phun thuốc thử vanilin- acid sulfuric có nhiều vết mới xuất hiện và quan sát
được dưới ánh sáng trắng, các vết sắc ký gọn và tách nhau khá rõ.
Khảo sát thể tích tiêm mẫu theo quy trình chuẩn bị dịch chiết nhận thấy ở thể tích
tiêm 1,5µl sắc ký đồ rõ nét, tách gọn, ít kéo đuôi nhất.
Từ kết quả trên, quy trình định tính bằng sắc ký lớp mỏng cho dịch chiết toàn
phần được lựa chọn với thể tích tiêm mẫu tiêm mẫu là 1,5µl và hệ dung môi pha động
là ethyl acetat: methanol: nước tỷ lệ 100:17:13, sắc ký đồ được quan sát ở các điều kiện:
bước sóng 254nm, 366nm trước khi phun thuốc thử, ánh sáng thường và bước sóng
366nm sau phun thuốc thử (hình ảnh sắc ký đồ khảo sát thể tích phun trong phụ lục 3).
3.1.2. Với dịch chiết sau thủy phân
Sau khi khảo sát các hệ dung môi pha động (mục 2.3.2), pha động ổn định và có
hiệu lực tách tốt nhất đối với dịch chiết sau thủy phân của mẫu GS1a là hệ dung môi số
7 gồm toluen: ethyl acetat: acid formic với tỷ lệ 5:4:1. Sau khi tiến hành phun thuốc thử
vanilin-acid sulfuric và hiện màu, hệ dung môi này cho sắc ký đồ gồm nhiều vết gọn và
rõ nét nhất.
Mặt khác khi tiêm mẫu dịch chiết ở thể tích tiêm mẫu 10µl các vết xuất hiện rõ
ràng, tách nhau ít chồng lấn và kéo đuôi, trên 10µl vết sắc ký đậm, phun thuốc thử hiện
màu bị kéo đuôi khó quan sát, tiêm dưới 10µl vết mờ hoặc mất vết.
Như vậy, hệ dung môi pha động toluen: ethyl acetat: acid formic tỷ lệ 5:4:1 và
thể tích tiêm mẫu 10µl là hệ dung môi và thể tích tiêm mẫu phù hợp nhất cho quá trình
phân tích vân tay sắc ký dịch chiết mẫu nghiên cứu GS1a sau thủy phân. Nhóm nghiên
cứu chọn các điều kiện này cho quá trình phân tích trên các mẫu còn lại (hình ảnh sắc
ký đồ khảo sát thể tích phun trong phụ lục 3).

31. 23
3.2. Kết quả xây dựng vân tay hóa học một số loài thuộc chi Gymnema R.Br.
3.2.1. Với dịch chiết toàn phần
Sau khi triển khai sắc ký dịch chiết toàn phần các mẫu thuộc 4 loài Gymnema
khác nhau với hệ dung môi và thể tích tiêm mẫu đã lựa chọn thu được sắc ký đồ của các
mẫu nghiên cứu ở các điều kiện quan sát khác nhau như hình 3.1 – trang 24. Trong các
hình ảnh sắc ký đồ thu được, sắc ký đồ ở ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử cho
nhiều vết sắc ký nhất, các vết gọn và khá rõ nên đề tài sử dụng hình ảnh sắc ký đồ này
để phân tích sự đa dạng về thành phần hóa học giữa các loài trong chi.
Tiến hành phân tích sự xuất hiện/không xuất hiện các vết sắc ký trên sắc ký đồ
của các mẫu nhóm 1 quan sát bằng VIS-TT bằng cách mã hóa nhị phân 1/0 (bảng 3.1 –
trang 26) nhận thấy sắc ký đồ của các mẫu/loài nghiên cứu khá giống nhau, chỉ có mẫu
loài G. inodorum có điểm khác biệt nhiều, cụ thể:
- Có 6 vết xuất hiện sau khi phun thuốc thử ở tất cả các mẫu nghiên cứu, Rf lần
lượt là: 0,22-màu nâu dưới ánh sáng thường và xám đậm dưới UV 366nm (trừ
mẫu GIa có màu xanh nhạt ); 0,39-màu xanh lá dưới UV 366nm; 0,55; 0,60 (xám
nhạt); 0,78 (xám nhạt) và 0,89 (màu xám đậm dưới ánh sáng thường, phát huỳnh
quang đỏ dưới đèn UV 366nm). Tại các vết có Rf=0,39; 0,55 và 0,61; trước phun
thuốc ở cả bước sóng 254nm và 366nm đều không xuất hiện (trừ mẫu GS2 có vết
0,39 phát huỳnh quang sáng dưới UV 366nm). Như vậy, vết sắc ký có Rf=0,39;
0,55 và 0,60 tương đối đặc trưng cho chi Gymnema R.Br. Các vết này được bôi
màu đỏ trong bảng 3.1 – trang 26.
- Các mẫu Dây thìa canh lá nhỏ loài G. sylvestre (GSx trừ GS2) xuất hiện nhiều
vết chung, ngoài các vết chung của chi còn có thêm tại Rf : 0,11; 0,29 (trừ mẫu
GS3); 0,33 (trừ mẫu GS4); 0,49; 0,65; 0,70 và 0,78 (trừ mẫu GS4); trong đó vết
0,70-xám nhạt trên sắc ký đồ VIS-TT chỉ xuất hiện ở loài này.
- Các mẫu trong loài Dây thìa canh lá to (GLx) cùng mẫu Dây thìa canh nhập nội
(GS2) có sắc ký đồ rất giống nhau sau khi phun thuốc thử, đều có các vết (trừ vết
chung của chi) tại Rf: 0,13; 0,17; 0,30; 0,34; 0,43; 0,49; 0,63. Sự khác biệt rõ nhất
giữa mẫu GS2 so với các mẫu trong loài Dây thìa canh lá to thể hiện rõ trên sắc
ký đồ trước phun thuốc thử ở UV 366nm: vết Rf=0,39 ở mẫu Dây thìa canh nhập
nội và vết 0,55 ở các mẫu Dây thìa canh lá to phát huỳnh quang sáng (đánh dấu
màu xanh trên bảng 3.1 – trang 26).

32. 24
Hình 3.1. Sắc ký đồ khai triển dịch chiết toàn phần của các mẫu Gymnema nhóm 1
Chú thích: a) Quan sát dưới UV 254nm trước khi phun thuốc thử; b) Quan sát dưới UV 366nm trước khi phun thuốc thử
c) Quan sát dưới ánh sáng trắng sau phun thuốc thử; d) Quan sát dưới UV 366nm sau phun thuốc thử.

33. 25
- Mẫu loài G. inodorum quan sát trên sắc ký đồ mẫu GIa ở ánh sáng trắng sau khi
phun thuốc thử nhận thấy mẫu này có sắc ký đồ khác biệt nhất: xuất hiện 2 vết
sắc ký ở Rf=0,08 có màu tím đậm, phát huỳnh quang nâu và Rf=0,22 có màu xanh
nhạt và phát huỳnh quang xanh khi quan sát dưới UV 366-TT sau phun thuốc
thử; các vết tại Rf=0,22; 0,38 và 0,70 phát huỳnh quang sáng chỉ xuất hiện ở mẫu
này trên bản trước phun thuốc thử soi dưới UV 366nm (đánh dấu màu xanh trên
bảng 3.1 – trang 26).
- Mẫu GYa (loài G. yunnanense) có sắc ký đồ nhiều tương đồng các mẫu khác
trong chi Gymnena R.Br., chỉ quan sát thấy điểm khác biệt khi soi UV 366nm
trước phun thuốc thử tại Rf=0,28 có xuất hiện vết cho huỳnh quang sáng không
xuất hiện trên các mẫu khác (đánh dấu màu xanh trên bảng 3.1 – trang 26).
Tiến hành chồng phổ sắc ký đồ của các dịch chiết mẫu Gymnema nhóm 1 sau khi
phun thuốc thử và quan sát dưới ánh sáng thường nhận thấy phổ từ Rf 0,35 trở lên giữa
các loài tương đồng nhau nhiều (hình 3.2).
Hình 3.2. Kết quả chồng phổ sắc ký dịch chiết toàn phần tại VIS-TT các mẫu
thuộc nhóm 1
Dữ liệu sắc ký đồ trước thủy phân chưa thể hiện được rõ sự khác biệt giữa các
mẫu/loài Gymnema nghiên cứu. Sắc ký đồ có khá nhiều vết và các vết chưa tách hẳn
nhau nên quá trình phân tích kết quả khó khăn. Đề tài đã tiến hành thủy phân các dịch
chiết theo mục 2.3.1.3 để tạo dịch chiết chọn lọc hơn và bộc lộ được các khung saponin
cấu trúc chính của từng loài, từ đó có những phân tích rõ ràng và chính xác hơn.

34. 26
Bảng 3.1. Sự xuất hiện các vết trên sắc ký đồ dịch chiết toàn phần mẫu nghiên
cứu nhóm 1 khi quan sát ở bản mỏng sau phun thuốc thử
Rfx100 GS1a GS2 GS3 GS4 GS5 GL1a GL2a GL3a GL4a GL5a GYa GIa
2 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1
6-8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1
11 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1
13 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0
17 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0
22 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
28 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
29 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1
30 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0
32-33 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1
38-39 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
42 0 1 0 0 0 1 1 1 1 0 1 0
48-49 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
54-55 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
60-61 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1
62-63 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1
65 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0
70 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0
77-79 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1
81-82 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0
86-88 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1
89-90 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Chú thích:
Các vết tương đồng xuất hiện ở tất cả các loài thuộc mẫu nghiên cứu
Các vết xuất hiện ở mẫu nghiên cứu cùng loài
Các vết đặc biệt – vết có cùng Rf nhưng khác về màu sắc quan sát được
(1-Có xuất hiện vết tại Rf tương ứng, 0-không xuất hiện; Số liệu sắc ký đồ trình bày
trong phụ lục 4)

35. 27
3.2.2. Với dịch chiết sau thủy phân
Triển khai sắc ký dịch chiết sau thủy phân các mẫu thuộc nhóm 1 (mục 2.1.1) với
hệ dung môi và thể tích tiêm mẫu ở mục 3.1.2 thu được sắc ký đồ của các mẫu nghiên
cứu. Hình ảnh sắc ký đồ sau thủy phân cho các vết với số lượng vừa phải, tách nhau khá
rõ và gọn dễ quan sát hơn. Hình ảnh sắc ký đồ với các điều kiện quan sát bao gồm UV
ở bước sóng 366nm và sánh sáng thường sau khi phun thuốc thử được sử dụng để phân
tích các kết quả cụ thể (hình 3.3 – trang 30).
Qua quan sát sắc ký đồ dưới ảnh sáng thường sau khi phun thuốc thử của các
mẫu nghiên cứu nhận thấy như sau: Mẫu Dây thìa canh Vân Nam G. yunnanense có sắc
ký đồ khác biệt rõ rệt so với các mẫu còn lại, mẫu Dây thìa canh nhập nội (GS2) có sắc
ký đồ tương tự các mẫu Dây thìa canh lá to và mẫu Dây thìa canh lá nhỏ có sắc ký đồ
có nhiều điểm tương đồng với mẫu Dây thìa canh G. idonorum.
3.2.2.1. Sắc ký đồ của các mẫu Dây thìa canh G. sylvestre
Khi quan sát sắc ký đồ của các các mẫu Dây thìa canh G.sylvestre nhận thấy các
mẫu chia thành 02 nhóm với sự khác biệt rõ rệt trên sắc ký đồ. Các mẫu nhóm 1 là các
mẫu Dây thìa canh lá nhỏ có sắc ký đồ tương tự nhau với 12 vết trên sắc ký đồ (bảng
3.2) thì chỉ có 2 vết có sự khác nhau: cụ thể tại vết ở Rf=0,89 không quan sát thấy trên
trên SKĐ mẫu GS4; vết 0,15 chỉ quan sát được ở mẫu GS3; vết ở Rf=0,83 mẫu GS3,
GS4 phát huỳnh quang khác màu (màu xanh nhạt so với màu nâu của mẫu GS1a và
GS4). Các vết còn lại đều xuất hiện với Rf và màu sắc như nhau ở tất cả các mẫu thuộc
loài Dây thìa canh lá nhỏ (kết quả tổng hợp thành bảng 3.2).
Nhóm 2 là mẫu Dây thìa canh nhập nội có sắc ký đồ khác biệt các mẫu Dây thìa
canh lá nhỏ nhưng lại có nhiều điểm tương tự với sắc ký đồ của các mẫu Dây thìa canh
lá to.

36. 28
Bảng 3.2. Tổng hợp Rf và màu sắc các vết trên sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân
các mẫu thuộc loài G. sylvestre quan sát ở VIS-TT hoặc UV 366-TT
STT vết Rf GS1a GS3 GS4 GS5
1 0,04 Xám/nâu nhạt Xám/nâu nhạt Xám/nâu nhạt Xám/nâu nhạt
2 0,11 Xám/nâu nhạt Xám/nâu nhạt Xám/nâu nhạt Xám/nâu nhạt
3 0,15 Xám/nâu nhạt
4 0,22 Xám/vàng nâu Xám/vàng nâu Xám/vàng nâu Xám/vàng nâu
5 0,28 Xám/xanh lá Xám/xanh lá Xám/xanh lá Xám/xanh lá
6 0,32 Xám đậm/nâu Xám đậm/nâu Xám đậm/nâu Xám đậm/nâu
7 0,42 Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu
8 0,49 Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu
9 0,51 Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu
10 0,57 Xám/nâu nhạt Xám/nâu nhạt Xám/nâu nhạt Xám/nâu nhạt
11 0,71 Xám/vàng đậm Xám/vàng đậm Xám/vàng đậm Xám/vàng đậm
12 0,79 Xám/xanh lá Xám/xanh lá Xám/xanh lá Xám/xanh lá
13 0,83 Xám/nâu Xám/xanh lá Xám/xanh lá Xám/nâu
14 0,89 Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu
(Chú thích: Bỏ trống là không có vết; màu sắc trước dấu sổ chéo là màu quan sát được
ở VIS-TT, sau sổ chéo là UV 366-TT)
3.2.2.2. Phân tích sắc ký đồ của các mẫu Dây thìa canh lá to
Sắc ký đồ dây thìa canh lá to và Dây thìa canh nhập nội có nhiều vết tương đồng:
cùng chung 6 vết: 0,22-màu nâu đậm; 0,31; 0,42; 0,47; 0,53 và 0,89 (cùng màu xám).
Về điểm hác biệt: quan sát thấy trên các mẫu Dây thìa canh lá to tổng cộng 14 vết, có 8
vết chung (gồm 6 vết chung với Dây thìa canh nhập nội và 2 vết tại Rf=0,05; 0,11).
Trong các mẫu thuộc loài G. latifolium cũng nhận thấy sự khác biệt: mẫu GL3a xuất
hiện thêm vết màu xám ở Rf=0,62; GL2a, GL3a thêm một vết ở 0,37 (màu xám); GL1a
không có vết tại 0,71 và 0,78. Đặc biệt vết ở Rf=0,22; 0,42 tuy xuất hiện cả ở các mẫu
thuộc loài khác nhưng khi soi dưới UV 366nm lại phát huỳnh quang xám khác biệt. Ba
vết Rf 0,22-nâu đậm; 0,42-xám và 0,53-xám có thể coi là vết đặc trưng cho loài G.
latifolium. Với mẫu Dây thìa canh nhập nội: quan sát thấy có 14 vết tất cả trên sắc ký
đồ VIS-TT, màu sắc và Rf chi tiết các vết tổng hợp trong bảng 3.3.

37. 29
Bảng 3.3. Tổng hợp Rf và màu sắc các vết trên sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân
các mẫu thuộc loài G. latifolium quan sát ở VIS-TT hoặc UV 366-TT
STT vết Rf GS2 GL1a GL2a GL3a GL4a GL5a
1 0,03 Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu
2 0,05 Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu
3 0,08 Xám/nâu
4 0,11 Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu
5 0,12 Xám/nâu
6 0,22
Tím đen/
nâu đậm
Tím đen/
nâu đậm
Tím đen/
nâu đậm
Tím đen/
nâu đậm
Tím đen/
nâu đậm
Tím đen/
nâu đậm
7 0,31 Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu
8 0,37 Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu
9 0,42 Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu
10 0,47 Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu
11 0,53 Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu
12 0,57 Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu
13 0,62 Xám/nâu Xám/nâu
14 0,71 Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu
15 0,78 Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu
16 0,89 Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu
(Chú thích: Bỏ trống là không có vết; màu sắc trước dấu sổ chéo là màu quan sát được
ở VIS-TT, sau sổ chéo là UV 366-TT)
3.2.2.3. Phân tích sắc ký đồ mẫu Dây thìa canh Vân Nam
Quan sát sắc ký đồ mẫu Dây thìa canh Vân Nam có tất cả 12 vết với Rf và màu
sắc được trình bày ở bảng 3.4, trong đó các vết tại Rf=0,10; 0,21; 0,59 và 0,63 đặc trưng
trên sắc ký đồ các mẫu loài G. yunnanense: vết 0,10-xám; 0,21-xám đậm; 0,59-xám đậm
chỉ xuất hiện trên trên mẫu GYa; vết 0,63 phát huỳnh quang xanh khi soi dưới UV
366nm khác biệt so với các mẫu khác trong chi. Xác định 4 vết này là 4 vết đặc trưng
cho loài G. yunnanense (bảng 3.4 – trang 31).
3.2.2.4. Phân tích sắc ký đồ mẫu Dây thìa canh G. idonorum
Quan sát trên sắc ký đồ mẫu Dây thìa canh G. inodorum có tất cả 12 vết với Rf
và màu sắc được trình bày ở bảng 3.4, trong đó có 3 vết đặc trưng tại Rf=0,22 và 0,71.
Vết 0,22 tuy cùng Rf các mẫu GLx và GSx nhưng soi UV 366nm lại phát huỳnh quang
vàng nâu khác biệt. Vết 0,71 cũng phát huỳnh quang vàng nâu và rất đậm chỉ xuất hiện
ở mẫu này. Như vậy, sơ bộ có thể coi 2 vết này là 2 vết đặc trưng cho loài G. inodorum
(bảng 3.4 – trang 31).

38. 30
Hình 3.3. Sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân của các mẫu Gymnema nhóm 1
Chú thích: a) Quan sát dưới ánh sáng trắng sau phun thuốc thử
b) Quan sát dưới UV 366nm sau phun thuốc thử

39. 31
Bảng 3.4. Tổng hợp Rf và màu sắc các vết trên sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân
các mẫu thuộc loài G. yunnanense và G. inodorum quan sát ở VIS-TT hoặc UV
366-TT
STT vết Rf GYa GIa
1 0,03 Xám/vàng nâu
2 0,05 Xám/xám
3 0,08 Xám/xám Xám/nâu
4 0,11 Xám/xám
5 0,15 Xám/nâu
6 0,17 Xám/nâu Xám/nâu
7 0,22 Xám/xám Xám/vàng nâu
8 0,27 Xám/nâu
9 0,29 Xám/xanh lá
10 0,32 Xám/nâu
11 0,35 Xám/hồng
12 0,47 Xám/xám
13 0,50 Xám/nâu
14 0,53 Xám/xám
15 0,57 Xám/xám Xám/nâu
16 0,60 Xám/xám Xám/nâu
17 0,63 Xám/xám
18 0,71 Tím đậm/nâu vàng
19 0,81 Xám/xanh lá Xám/nâu
20 0,89 Xám/xám Xám/nâu
(Chú thích: Bỏ trống là không có vết; màu sắc trước dấu sổ chéo là màu quan sát được
ở VIS-TT, sau sổ chéo là UV 366-TT)
3.3. Kết quả xây dựng cây phân loại dựa trên kết quả sắc ký lớp mỏng của các mẫu
Gymnema nghiên cứu
Theo vân tay sắc ký thu được từ mục 3.2. Nhận thấy kết sắc ký đồ dịch chiết sau
thủy phân khi quan sát ở ánh sáng trắng và so sánh màu ở UV 366nm có sự khác nhau
nhiều hơn kết quả quan sát ở dịch chiết toàn phần, do đó nhóm nghiên cứu chọn sắc ký
đồ dịch chiết sau thủy phân để xây dựng cây phân loại các mẫu.
Tổng hợp kết quả các bảng 3.2, 3.3 và 3.4 thành bảng mã hóa nhị phân mở rộng:
thêm một biến phụ (bên cạnh biến chính trùng Rf) là màu sắc khi quan sát dưới UV
366nm (trùng Rf và màu giống nhau = 1; trùng Rf khác màu nhau = 0). Bảng nhị nhân
mở rộng (trong phụ lục 4) được dùng làm dữ liệu tính toán hệ số Nei&Li và vẽ cây phân

40. 32
loại.
Kết quả thu được hệ số tương đồng giữa các mẫu có giá trị từ 0,41 đến 1,00 (bảng
3.5). Về cây phân loại, các mẫu cơ bản được chia thành 4 nhóm (hình 3.4), cụ thể là:
- Nhóm 1 gồm các mẫu Dây thìa canh lá nhỏ (G. sylvestre): GS1a, GS3, GS4, GS5
có hệ số tương đồng với nhau lên đến 0,92. Nhóm này lại gồm 2 nhánh nhỏ có
hệ số tương đồng cao hơn là GS4, GS3 (0,95) và đặc biệt hai mẫu GS1a và GS5
giống nhau 100% hình ảnh sắc ký đồ quan sát được.
- Nhóm 2 là mẫu G. inodorum (GIa). Cây phân loại cho thấy mẫu GIa và nhóm 1
có chung một gốc lớn, tức là tương đồng nhau hơn các nhánh còn lại; trên bảng
hệ số Nei&Li thấy sắc ký đồ GIa có hệ số tương đồng với các mẫu nhóm 1 từ
0,61 đến 0,64.
- Nhóm 3 gồm các mẫu Dây thìa canh lá to (GLx) và mẫu Dây thìa canh nhập nội
(GS2) có độ tương đồng nhau trong nhóm từ 0,79 trở lên. Nhóm này lại tách ra
thành 2 nhóm là GS2 và các mẫu GLx. Các mẫu GLx phân ra nhỏ hơn thành 3
nhóm (GL2a cùng GL4a; GL3a cùng GL5a; và GL1a) tuy nhiên có hệ số tương
đồng cao >90%.
- Nhóm 4 là mẫu GYa loài G. yunnanense khác biệt nhất trong các mẫu nghiên
cứu: hệ số tương đồng với các mẫu khác chỉ từ 0,41 đến 0,62 và là nhóm ngoài
cùng của cây phân loại (bảng 3.5 và hình 3.4).

41. 33
Hình 3.4. Cây phân loại dựa trên phân tích UPGMA hệ số tương đồng giữa sắc
ký đồ của các mẫu
Bảng 3.5. Bảng hệ số tương đồng cặp đôi giữa các mẫu nghiên cứu, sử dụng chỉ số
Nei&Li
GS1a GS2 GL1a GL2a GL3a GL4a GL5a GYa GIa GS3 GS4 GS5
GS1a 1,00
GS2 0,56 1,00
GL1a 0,51 0,79 1,00
GL2a 0,56 0,85 0,90 1,00
GL3a 0,51 0,85 0,95 0,95 1,00
GL4a 0,54 0,85 0,92 0,97 0,97 1,00
GL5a 0,54 0,87 0,92 0,97 0,97 0,95 1,00
GYa 0,49 0,82 0,46 0,46 0,46 0,44 0,48 1,00
GIa 0,62 0,51 0,59 0,53 0,54 0,51 0,56 0,46 1,00
GS3 0,92 0,59 0,49 0,49 0,44 0,86 0,46 0,41 0,64 1,00
GS4 0,92 0,49 0,49 0,49 0,44 0,46 0,46 0,41 0,64 0,95 1,00
GS5 1,00 0,56 0,51 0,56 0,51 0,54 0,54 0,49 0,61 0,92 0,92 1,00

42. 34
3.4. Kết quả phân tích sắc ký đồ của một số mẫu Dây thìa canh thu được trên thị
trường
Sắc ký đồ của các mẫu Dây thìa canh trên thị trường (mẫu nhóm 2) được khai
triển trên cùng bản mỏng với các mẫu Gymnema nhóm 1. Sau khi chồng phổ các mẫu
này với nhau thấy các mẫu GX2, GX3 có sắc ký đồ nhiều điểm tương đồng với sắc ký
đồ của GS1; mẫu GX4 nhiều điểm tương đồng với GI. Riêng sắc ký đồ mẫu GX1 có đặc
điểm của các mẫu Dây thìa canh lá nhỏ (G. sylvestre) và Dây thìa canh lá to (G.
latifolium). Các kết quả trên quan sát thấy ở cả sắc ký đồ dịch chiết toàn phần và dịch
chiết sau thủy phân.
Hình ảnh chồng phổ được phân ra làm 3 nhóm như hình 3.5, hình 3.6 và hình 3.7
(hình ảnh bản mỏng và số liệu sắc ký ở phụ lục 5).
Hình 3.5. Kết quả chồng phổ sắc ký đồ các mẫu GX2, GX3 và sắc ký đồ GS1
Chú thích: a) Dịch chiết toàn phần; b) Dịch chiết sau thủy phân.

43. 35
Các mẫu có phổ tương đồng phổ GS1: 2 mẫu GX2, GX3 có các pic tương ứng vị
trí các pic trên sắc ký đồ GS1:
- Trên phổ dịch chiết toàn phần trùng các vết đặc trưng chi: Rf=0,22-màu nâu,
0,39-màu xanh lá, 0,55; 0,60-xám nhạt, 0,78-xám nhạt và 0,89-màu xám đậm; đặc biệt
có vết đặc trưng của mẫu Dây thìa canh lá nhỏ-vết Rf=0,7-màu xám nhạt khi quan sát ở
VIS-TT.
- Trên phổ dịch chiết sau thủy phân trùng Rf và màu sắc các vết: 0,22-tím đậm,
0,57-xám; 0,79-xám và phát huỳnh quang vàng nâu khi soi dưới UV 366nm là các vết
có màu đặc biệt trên sắc ký đồ Dây thìa canh lá nhỏ.
Kết hợp với kết quả chồng phổ sơ bộ kết luận các mẫu GX2, GX3 có dược liệu
loài G. sylvestre và có thành phần tương đồng gymnemagenin trong dược liệu (hình 3.5).
Hình 3.6. Kết quả chồng phổ sắc ký đồ mẫu GX4 và sắc ký đồ GI
Chú thích: a) Dịch chiết toàn phần; b) Dịch chiết sau thủy phân.

44. 36
Mẫu GX4 có phổ gần như trùng phổ GI, có các pic đặc trưng của GI (Rf=0,08-
màu tím đậm; 0,22-phát huỳnh quang xanh dưới UV 366nm trên sắc ký đồ dịch chiết
toàn phần; và Rf=0,22; 0,71 phát huỳnh quang vàng nâu dưới UV 366nm trên sắc ký đồ
dịch chiết sau thủy phân). Sơ bộ kết luận mẫu GX4 có chứa dược liệu loài G.inodorum
(hình 3.6).
Hình 3.7. Kết quả chồng phổ sắc ký đồ mẫu GX1 và sắc ký đồ GS1, GL1
Chú thích: a) Dịch chiết toàn phần; b) Dịch chiết sau thủy phân.
Mẫu GX1 sắc ký đồ ngoài xuất hiện các pic đặc trưng trên mẫu loài Dây thìa
canh lá nhỏ còn có cả các đặc điểm nhận dạng của mẫu thuộc loài Dây thìa canh lá to-
GLx: có vết sắc ký ở Rf=0,55 - phát huỳnh quang sáng trên sắc ký đồ quan sát dưới UV
366nm ở bản trước phun thuốc thử dịch chiết toàn phần (hình ảnh SKĐ trong phụ lục
5). Sơ bộ kết luận mẫu GX1 chứa dược liệu chi Gymnema của 2 loài G. sylvestre và G.
latifolium (hình 3.7).

45. 37
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN
4.1. Về kết quả khảo sát quy trình định tính bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao
Để có thể xây dựng vân tay sắc ký của các mẫu nghiên cứu bằng sắc ký lớp mỏng
việc lựa chọn dung môi và thể tích phun sắc ký sẽ ảnh hưởng nhiều đến kết quả phân
tích. Để đảm bảm độ chính xác và độ lặp lại thì việc sàng lọc điều kiện để xây dựng quy
trình định tính là cần thiết để có được kết quả tối ưu.
Hệ dung môi pha động là một trong những yếu tố quan trọng nhất tác động đến
kết quả sắc ký đồ, để có thể tách được nhiều vết và các vết gọn, tác rõ nhau, cần thiết
phải lựa chọn dung môi có độ phân cực phù hợp. So với dịch chiết toàn phần, các thành
phần hóa học trong dịch chiết sau thủy phân có độ phân cực kém hơn do đã bị cắt các
nhóm đường, do đó, hệ dung môi pha động cho dịch chiết sau thủy phân là toluen:
ethylacetat: acid formic (5:4:1) có độ phân cực kém hơn so với hệ dung môi phù hợp
tác các chất trong dịch chiết toàn phần là ethylacetat: methanol: nước (100:17:13). Mặt
khác, để các vết trong sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân có độ phân giải cao hơn và ít
kéo đuôi hơn, việc sử dụng dung môi toluen và acid formic là cần thiết.
Bên cạnh đó, việc khảo sát lượng mẫu đưa lên bản mỏng (thể tích tiêm mẫu) sẽ
ảnh hưởng đến số lượng vết hiển thị và độ đậm nhạt của các vết trên sắc ký đồ. Kết quả
cho thấy ở thể tích tiêm mẫu chỉ 1,5µl dịch chiết toàn phần đã cho sắc ký đồ tách rõ
nhất; tuy nhiên với dịch chiết sau thủy phân cần tiêm ở 10µl sắc ký đồ mới tối ưu. Tiêm
mẫu thể tích lớn hơn làm kéo dài thời gian tiêm mẫu và làm các vết sắc ký bị kéo đuôi
và khó tách ra khỏi nhau.
Như vậy, nghiên cứu đã bước đầu sàng lọc được 2 yếu tố ảnh hưởng đến quá
trình phân tích TLC là thể tích tiêm mẫu và dung môi pha động để xây dựng được một
quy trình phân tích tối ưu cho ra các sắc ký đồ phù hợp của các mẫu nghiên cứu.
4.2. Về kết quả cao xây dựng vân tay hóa học một số mẫu thu được trong chi
Gymnema R.Br.
Qua quá trình phân tích sắc ký đồ dịch chiết trước và sau thủy phân của các mẫu
nghiên cứu nhận thấy trên sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân, các vết sắc ký xuất hiện
rõ ràng và gọn hơn, ít vết sắc ký hơn, màu sắc cũng khác biệt so với các vết trên sắc ký
đồ của dịch chiết toàn phần. Điều này cho thấy quá trình thủy phân và chiết bằng dung
môi ethylacetat đã thay đổi các chất có trong dịch chiết toàn phần về cả số lượng lẫn cấu
trúc.

46. 38
Ở sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân, trừ mẫu G. yunnanense, các mẫu đều có
vết trùng Rf với chất chuẩn gymnemagenin, nhưng chỉ có các mẫu Dây thìa canh lá to
và mẫu Dây thìa canh nhập nội là có cùng màu sắc với vết chuẩn gymnemagenin khi soi
dưới UV 366nm (màu nâu). Kết hợp các kết quả trên có thể sơ bộ kết luận,
gymnemagenin chỉ có trong dịch chiết sau thủy phân của loài Dây thìa canh lá to G.
latifolium và loài Dây thìa canh nhập nội; trên các loài còn lại, hoạt chất trên vết trùng
hệ số di chuyển với gymnemagenin có thể là chất có khung cấu trúc tương đồng. Kết
quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu trên thế giới từ đó có thể thấy Dây thìa canh
nhập nội có nguồn gốc gần với Dây thìa canh ở Ấn độ và khác biệt với các mẫu Dây
thìa canh lá nhỏ tại Việt Nam.
Vết đặc trưng chi và vết đặc trưng loài: Từ kết quả sắc ký đồ xác định được vết
đặc trưng chi và vết đặc trưng loài được liệt kê trong mục 3.2.2. Bên cạnh các vết đặc
trưng cho chi và cho loài, các giống Dây thìa canh khác nhau cũng có những điểm phẩn
biệt trên sắc ký đồ. Việc cách ly xã hội trong quá trình dịch bệnh làm ảnh hưởng đến
quá trình thu mẫu, đề tài mới chỉ thu được sự đa dạng dưới loài của các mẫu Dây thìa
canh lá nhỏ (5 mẫu) và Dây thìa canh lá to (5 mẫu), số lượng mẫu thu được của loài G.
inodorum và các loài còn lại còn hạn chế (do mẫu Vân Nam và mẫu nhập nội chỉ có duy
nhất một giống). Tuy nhiên kết quả sắc ký đồ của các giống trong một loài lại có nhiều
nét tương đồng và có sự khác biệt chủ yếu xảy ra trên sắc ký đồ của các loài khác nhau.
Do đó, tuy số lượng mẫu của đề tài còn hạn chế nhưng những kết quả bước đầu về sắc
ký đồ vẫn cung cấp một cơ sở dữ liệu có ý nghĩa nhất định khi so sánh về vân tay sắc ký
lớp mỏng giữa các loài Dây thìa canh với nhau.
4.3. Về kết quả xây dựng cây phân loại hóa học các mẫu nghiên cứu
Qua phân tích hình ành sắc ký đồ kết hợp với mã hóa và phân tích dữ liệu bằng
phần mềm NTSYSpc 2.1, đề tài đã xây dựng được cây phân loại dựa trên hệ số tương
đồng cho thấy hình ảnh trực quan thể hiện mối quan hệ giữa các loài trong cùng bậc
taxon thực vật thường có các thành phần hóa học tương tự nhau do đó có xu hướng có
tác dụng sinh học giống nhau.
Kết quả cây phân loại chia các mẫu ra làm 4 nhóm: nhóm 1 là mẫu thuộc loài G.
sylvestre, nhóm 2 mẫu thuộc loài G. inodorum, nhóm 3 mẫu thuộc loài G. yunnanense,
nhóm 4 các mẫu thuộc loài G. latifolium và mẫu Dây thìa canh nhập nội-GS2. Điều đặc
biệt là trong các mẫu thuộc loài G. sylvestre, mẫu Dây thìa canh nhập nội-GS2 có sắc

47. 39
ký đồ khác hẳn so với các mẫu còn lại và tương tự với các mẫu Dây thìa canh lá to. Khi
so sánh với nghiên cứu năm 2018 của Phạm Hà Thanh Tùng và cộng sự [37], kết quả
của đề tài có sự tương đồng nhất định khi chỉ ra sự khác biệt của hai giống này. Theo
đó, giống Dây thìa canh nhập nội có nguồn gốc từ Ấn Độ có nhiều điểm khác biệt về cả
hình thái thực vật và thành phần hóa học với giống Dây thìa canh lá nhỏ sinh trưởng ở
Việt Nam, thành phần hóa học của nó tương tự với thành phần hóa học của loài Dây thìa
canh lá to với hàm lượng lớn các chất có khung aglycon là gymnemagenin [37].
Mặt khác, cũng tại nghiên cứu này, tác giả đã xây dựng cây phân loại về da dạng
di truyền đoạn trình tự ITS của một số mẫu thuộc chi Gymnema R.Br. Kết quả cho thấy
giống Dây thìa canh nhập nội và Dây thìa canh lá nhỏ nằm ở hai nhóm khác nhau. Giả
thiết cho sự khác nhau này có thể là do hai giống sinh trưởng khác biệt về mặt địa lý,
thổ nhưỡng và khí hậu trong thời gian dài nên đã tích lũy và tiến hóa theo những hướng
khác nhau [37].
Như vậy kết quả sự khác biệt về hóa học trên sắc ký đồ mà nhóm nghiên cứu
quan sát được khẳng định lại chứ không hề mẫu thuẫn các nghiên cứu trước đó. Tuy
nhiên, với hệ số tương đồng giữa các loài khoảng 46% (hình 3.5), có cơ sở hoạt chất có
tác dụng sinh học của loài này cũng có ở loài kia. Điều này cũng phù hợp với các nghiên
cứu đã chứng minh G. latifolium, G. yunnanense, G. inodorum cũng có tác dụng hạ
đường huyết giống như G. sylvestre.
4.4. Về kết quả ứng dụng vân tay sắc ký phân tích sắc ký đồ của một số mẫu Dây
thìa canh thu được trên thị trường
Áp dụng các kết quả vân tay xây dựng được từ các mẫu nghiên cứu đã sơ bộ
nhận biết được một số mẫu dược liệu thị trường là dược liệu các loài thuộc chi Gymnema,
cụ thể chứa các loài G. sylvestre (mẫu GX2, GX3), G. inodorum (GX4) và mẫu GX1
chứa dược liệu thuộc 2 loài G. sylvestre, G. latifolium. Như vậy, dựa trên các tiêu chí
tương đồng về Rf, màu sắc vết và chồng phổ sắc ký đồ ban đầu có thể sơ bộ nhận biết
nhanh sự có mặt hay không có mặt của Dây thìa canh cũng như dự đoán được loài nào
có trong các mẫu sản phẩm từ Dây thìa canh thu được trên thị trường. Tuy nhiên, để có
những kết luận chính xác hơn, nên tiến hành xây dựng dữ liệu dấu vân tay hóa học trên
số lượng lớn các mẫu thuộc các loài khác nhau, tập hợp kết quả và lưu trữ thành ngân
hàng dữ liệu, từ đó, hoàn toàn có thể sử dụng lượng dữ liệu này để nhận dạng một mẫu
bằng phương pháp so sánh sắc ký đồ khai triển bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao.

48. 40
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
KẾT LUẬN
1. Đã khảo sát được 02 thông số quy trình phân tích sắc ký HPTLC để cho kết quả tối
ưu là hệ dung môi pha động và thể tích phun mẫu trên bản mỏng, kết quả hệ ethy acetat:
methanol: nước tỷ lệ 100:17:13, phun mẫu ở thể tích 1,5µl tối ưu với dịch chiết toàn
phần; hệ pha động toluen: ethyl acetat: acid formic tỷ lệ 5:4:1, phun mẫu ở thể tích 10µl
tối ưu với dịch chiết sau thủy phân.
2. Đã xây dựng được vân tay sắc ký một số loài chi Gymnema R.Br từ các mẫu thu được,
vân tay gồm sự xuất hiện, màu sắc, Rf của tất cả các vết có trên sắc ký đồ. Kết quả cho
thấy dịch chiết sau thủy phân có vân tay rõ ràng hơn dịch chiết toàn phần, sự khác nhau
giữa các loài rõ ràng hơn giữa các giống cùng loài, trừ hai mẫu Dây thìa canh lá nhỏ và
Dây thìa canh nhập nội cho kết quả khác nhau nhiều tuy trong cùng loài G. sylvestre.
3. Đã xây dựng được cây phân loại hóa học dựa trên kết quả mã hóa sắc ký đồ các mẫu
cho kết quả các mẫu tương đồng nhau trên 46% chia làm 4 nhóm. Kết quả phù hợp với
kết quả vân tay sắc ký cũng như các các nghiên cứu đã được công bố.
4. Đã ứng dụng vân tay sắc ký xây dựng được sơ bộ nhận biết được 04 mẫu dược liệu
Dây thìa canh trên thị trường có chứa thành phần thuộc chi Gymnema R.Br.
ĐỀ XUẤT
Tiếp tục thu thập thêm các mẫu thuộc các loài khác nhau trong chi Gymnema
R.Br. để có thể tập hợp và lưu trữ kết quả thành ngân hàng dữ liệu dấu vân tay hóa học,
từ đó tiến tới sử dụng bộ dữ liệu vân tay hóa học trong nhận dạng các mẫu phức tạp hơn
như các mẫu bán thành phẩm (dược liệu nhiều thành phần, cao dược liệu, bài thuốc đông
y,…)

49. TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Trần Tử An, Thái Nguyễn Hùng Thu (2006), Hóa phân tích, Tập II, Trường đại học
Dược Hà Nội, tr. 125-146, 173-210.
2. Trần Thế Bách (2007), Nghiên cứu phân loại Họ Thiên Lý ở Việt Nam, Luận án Tiến
sỹ Sinh học, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật.
3. Lê Đình Bích (2007 ), Thực vật Dược, Nhà Xuất bản Y học, trang 302-306
4. Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng (Tập 2), NXB Khoa học và Kỹ
thuật Hà Nội.
5. Phạm Văn Hải (2010), Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác
dụng sinh học của cây Dây thìa canh lá to ở Hòa Bình, Khóa luận tốt nghiệp, Thư
viện trường Đại học Dược Hà Nội.
6. Nguyễn Thị Thu Hiền (2014), Nghiên cứu đặc điểm hình thái, di truyền và bán định
lượng Gymnemagenin của loài dây thìa canh lá to (Gymnema Latifolium Wall. Ex
Wight) ở Việt Nam, Luận văn thạc sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội.
7. Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam (Tập 2), NXB Trẻ, trang 671-703
8. Hội đồng Dược điển Việt Nam (2017), Dược điển Việt Nam V, tập 2, Nhà xuất bản
Y học, Hà Nội, tr. PL88, PL290.
9. Đoàn Thị Thanh Hương (2016), Nghiên cứu tinh chế saponin từ dây thìa canh lá to
bằng nhựa macroporous D101, Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ, Thư viện trường Đại
học Dược Hà Nội, Hà Nội.
10. Đoàn Thị Ái Nghĩa (2014), Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng hạ đường
huyết của Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight), Luận văn Thạc
sỹ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội.
11. Trần Thị Oanh (2014), Nghiên cứu sản xuất chế phẩm hỗ trợ điều trị tiểu đường từ
cây dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. Ex Wight), Báo cáo kết quả khoa
học công nghệ, Hà Nội.
12. Trần Văn Ơn (2011), Sàng lọc các dược liệu có tác dụng điều trị đái tháo đường ở
Việt Nam và nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính, hạ đường huyết của một số
dược liệu điển hình, Đề tài khoa học và phát triển công nghệ cấp Bộ.
13. Thái Nguyễn Hùng Thu (2010), Sắc ký lớp mỏng, Tài liệu dùng sau đại học, Thư
viện trường Đại học Dược Hà Nội.

50. 14. Đinh Thị Thu Thủy (2014), Đánh giá tác dụng hạ glucose máu của dịch chiết lá các
loài trong chi Gymnema R.Br ở Việt Nam, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Thư viện
trường Đại học Dược Hà Nội.
15. Phạm Hà Thanh Tùng (2012), Nghiên cứu tính đa dạng thực vật và thành phần hóa
học của các loài trong chi Gymnema R.Br. ở Việt Nam, Luận văn Thạc sỹ Dược học,
Trường Đại học Dược Hà Nội.
16. Đỗ Anh Vũ (2007), Nghiên cứu đặc điểm thực vật và tác dụng hạ đường huyết của
cây Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult.), Khóa luận tốt
nghiệp Dược sỹ, Thư viện Trường Đại học Dược Hà Nội.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
17. Agatonovic-Kustrin Snezana, Morton David W (2019), Thin-Layer
Chromatography: Fingerprint Analysis of Plant Materials, Encyclopedia of
Analytical Science (3rd
edition), ScienceDirect, pp. 43-49.
18. Ananthan R., Latha M., Ramkumar K. M., Pari L., Baskar C. and Narmatha Bai V.
(2004), "Modulatory effects of Gymnema montanum leaf extracton alloxan-induced
oxidative stress in Wistar rats," Nutrition, 20, 280-285.
19. Ankit Saneja, Chetan Sharma, K.R. Aneja, Pahwa Rakesh (2010), "Gymnema
Sylvestre (Gurmar): A Review", Der Pharmacia Lettre, 2 (1) pp. 275-284
20. Armen Takhtajan (2009), Flowering Plants (2nd edition), Springer Science &
Business Media.
21. Bingtao Li M. G. G. W. D. S. and Tsiang Ying L. P.-t. (1995), Asclepiadaceae R.
Brown. In Wu, Z. Y. & P. H. Raven, eds. 1995. Flora of China. Vol. 16
(Gentianaceae through Boraginaceae). Science Press, Beijing, and Missouri
Botanical Garden Press, St. Louis. 479 pp.
22. Chakraborty D1 Ghosh S, Bishayee K, Mukherjee a, Sikdar S, Khuda- Bukhsh Ar.
(2013), "Antihyperglycemic drug Gymnema sylvestre also shows anticancer
potentials in human melanoma A375 cells via reactive oxygen species generation
and mitochondria-dependent caspase pathway.", Integr Cancer Ther. , 12(5), pp.
433-441.
23. Doyle J.J. D. J. L. (1990), Isolation of Plant DNA from fresh tissue, Focus, 12, 13 -
15.
24. Gurav e. a. S. (2007), “Pharmacognosy, phytochemistry, pharmacology and clinical
applications of Gymnema sylvestre R Br.”, Pharmacognosy Reviews, 338-343.

51. 25. Hostettmann M. (1995), Saponins - Chemistry and pharmacology of natural
products, Cambridge University Press
26. Inoue K., Yamada H., Imoto T. and Akasaka K. (1998), "High pressure NMR study
of a small protein, gurmarin," Journal of biomolecular NMR, 12, 535-541.
27. Inthakoun L. and Delang C. O. (2008), Lao Flora - A checklist of plants found in
Lao PDR with scientific and vernacular names, Lulu Press.
28. Jijun, C., Shengxiang, Q., Zhuangxin, Z., & Jun, Z. (1989), "THE CHEMICAL
CONSTITUENTS OF GYMNEMA YUNNANENSE", Acta Botanica
Yunnanica, 2.
29. Jingyun Fang Z. W., Zhiyao Tang (2011), Atlas of woody plants in China
(Distribution and Climate), Higher education Press, Springer.
30. Joshi Devi Datt (2012), Herbal drugs and fingerprints: Evidence based herbal
drugs, Springer Science & Business Media, pp. 19-27.
31. Leslie S. Ettre (2008), Milestones in the evolution of chromatography,
ChromSource, Inc, Portland, pp.129-136.
32. Lu F. Y., Kao, M. T., Huang, S. F. & Wang, J. C. (1998), Flora of Taiwan -
Asclepiadaceae (2nd edition), Editorial Committee of the Flora of Taiwan, Taipei.
33. Murakami N., Murakami T., Kadoya M., Matsuda H., J. and Yoshikawa M. (1996),
"New hypoglycemic constituents in "gymnemic acid" from Gymnema sylvestre,"
Chemical & pharmaceutical bulletin, 44, 469-471.
34. Nakamura Y., Tsumura Y., Tonogai Y. and Shibata T. (1999), "Fecal steroid
excretion is increased in rats by oral administration of gymnemic acids contained in
Gymnema sylvestre leaves," The Journal of nutrition, 129, 1214-1222.
35. Organization World Health (1993), Research guidelines for evaluating the safety
and efficacy of herbal medicines, Manila: WHO Regional Office for the Western
Pacific, pp.
36. Palanisamy Rajaguru Kunga Mohan Ramkumar, Muniappan Latha, Rajendran
Ananthan, (2007), "Ethanol extract of Gymnema montanum leaves reduces
glycoprotein components in experimental diabetes" Nutrition Research 27, 97-103.
37. Pham, H. T. T., Hoang, M. C., Ha, T. K. Q., Dang, L. H., Tran, V. O., Nguyen, T.
B. T., ... & Oh, W. K. (2018), "Discrimination of different geographic varieties of
Gymnema sylvestre, an anti-sweet plant used for the treatment of type 2 diabetes",
Phytochemistry, 150, 12-22.